DNA 的限制性内切酶酶切分析

DNA的限制性内切酶酶切分析实验十二限制性内切酶(RestrictionEndonuclease,RE):由细菌自身产生，能识别双链DNA分子中特定的碱基顺序，以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键，产生粘性末端或平头末端实验原理EcoRI的作用模式图:产生5突出粘性末端**********GAATTC******************CTTAAG********5353EcoRI********G********CTTAA53－OH－P－AATTC*******G*******35POH－55EcoRIBcl-2(1.9kb)pBS(2.96kb)pBS-Bcl-2(4.86kb)Bcl-2重组质粒的酶切模式图1.酶切:20ul反应体系组分加入体积灭菌双蒸水11ul10×bufferH(含BSA）2ul质粒DNA5ul10U/ulEcoRI2ul掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h操作步骤（改动）4.点样：1ul含SYBRGreenI的载样buffer+5ul酶切产物或+5ul未酶切的质粒,混匀。（点样孔置负极端）3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽(先胶布封口，放好梳子)。2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示剂)移动至胶前沿2cm处停止电泳(约30min)。（不超过5V/cm胶长度）6.观察结果：紫外分析仪上254nm观察，DNA存在处显绿色荧光条带，观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。100bpDNAMarker已酶切质粒未酶切质粒3000bp1500bp1000bp500bp2.96kp1.9kp点样孔注意事项1.第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离心到底部!2.当样品在37℃水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切失败3.RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油)，每次吸取后应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装4.倒胶时不能有气泡，若有需立刻用枪尖吸掉或牙签挑破5.点样孔置负极一端，点样时也应检查点样孔中有无气泡，电泳前正确连接正负极6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长思考题：1.DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请说明原因。2.比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前两个实验，分析可能的原因