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1.2基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、获取目的基因的方法（一）从基因文库中获取（二）利用PCR技术扩增（三）人工合成①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：___________、_______________、___________、___________②原理：__________多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板DNA四种脱氧核苷酸2种引物TaqDNA聚合酶（二）利用PCR扩增目的基因④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：_______________________________________________________指数2n使目的基因的片段在短时间内大量扩增⑥过程a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链⑦前提__________________________________________________有一段已知目的基因的核苷酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（DNA合成仪）（三）人工合成若基因_____，核苷酸序列______，可用此法。较小已知（化学合成法）mRNAcDNA单链cDNA分子逆转录酶DNA聚合酶（三）人工合成（反转录法）与直接提取的DNA相比cDNA不含有_____、_____和_____等结构1、基因表达载体的构建目的二、基因表达载体的构建（核心）使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达，而且可以遗传给后代。2、基因表达载体的组成：目的基因标记基因启动子终止子①用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。②用_____________切断目的基因，使其产生_________________。3、基因表达载体的构建过程③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法（双子叶植物或裸子植物）基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca+处理法1、将目的基因导入植物细胞的方法：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：①农杆菌特点：（1）农杆菌转化法Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③过程：1、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上2、将重组Ti质粒导入农杆菌3、用农杆菌感染植物体细胞2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：取卵显微注射受精卵早期胚胎培养胚胎移植3、将目的基因导入微生物细胞用Ca2+处理细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子感受态细胞四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因四、目的基因的检测与鉴定大肠杆菌四、目的基因的检测与鉴定抗原－抗体杂交法分子杂交法DNA分子杂交法目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否导入方法检测对象结果个体水平的鉴定是否显示出杂交带四、目的基因的检测与鉴定个体水平的鉴定（抗虫或抗病接种实验）1、鉴定转基因抗虫棉是否具有抗虫性可采用___________实验2、如何鉴定转基因抗盐烟草是否成功？在转基因抗盐烟草田中浇灌盐水，观察其是否有抗盐特性3、转基因奶牛生产人血清白蛋白，如何确定转基因牛培养成功？检测羊乳中是否含有人的血清白蛋白棉铃虫接种实验归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR技术人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：是否有转基因特性乳腺生物反应器1.目的基因是什么？药用蛋白基因2.目的基因前需加的什么启动子？乳腺蛋白基因的启动子3.受体细胞是什么？受精卵4.分泌蛋白质的细胞是？乳腺分泌细胞5.将目的基因导入受体细胞的方法？显微注射法练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是___________。显微注射2）进行基因转移是，通常要将外源基因转到______中，原因是：＿＿＿＿＿＿受精卵①具有发育的全能性；②体积大，易操作。3）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的_________细胞中特异表达。膀胱上皮4）通常采用_____________技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组DNA分子杂交5）检测人的生长激素是否成功表达可采用________技术抗原--抗体杂交6）与乳腺生物反应器相比，膀胱反应器有什么优点？①不受性别的限制；②没有是否处于生殖期的限制。