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临床生物化学实验室基本技术与实验室质量管理第一节常用临床生物化学分析技术第二节常用免疫分析技术(自学)第三节生物芯片和生物传感技术第四节酶蛋白分离纯化技术(自学)第一节常用临床生物化学分析技术一、光谱分析技术二、电泳技术三、离心技术(了解)四、层析技术五、电化学分析技术一、光谱分析技术(一)吸收光谱分析法(二)发射光谱分析法(三)散射光谱分析法(一)吸收光谱分析法1.原理：利用物质吸收光谱谱系特征，确定其性质、结构或含量的技术。2.方法学评价优点：(1)灵敏度高，检测浓度在10-5~10-2mol/l范围。(2)操作简便、快速、选择性好和应用广泛。(3)原子吸收分光光度法使用空心阴极灯作光源，谱线简单，由谱线重叠引起的干扰小(4)原子吸收分光光度法自动化程度高，在复杂样品分析中，可直接测定多种元素。缺点：(1)比色法需有标准品，有些反应的显色剂本身颜色会影响测定方法的灵敏度和特异性。(2)紫外法的吸收池需用石英玻璃作光学面。(3)原子法需特定元素的空心阴极灯，对难熔元素测定的灵敏度不够理想。CONTINUE3.类型：可见光及紫外光、原子吸收分光光度法(参考方法)4.临床应用（1）可见光及紫外光法多用于酶试剂终点法及化学法测定的项目（2）原子吸收分光光度法中用于Ca2+、Mg2+定值或参考方法(二)发射光谱分析法1.原理：利用物质发射光谱特征，来确定其性质、结构或含量的技术。2.类型：荧光分析法：灵敏度高，检测范围广，临床常用。火焰光度法：操作烦琐，干扰因素多，已淘汰。3.影响荧光强度的因素：(1)溶剂。与荧光强度成反比。(2)荧光物质的浓度。F=I，I是激发光强度。浓度很小且厚度不变时成正比。反之，则反比。(3)温度。多数情况下，与荧光强度成反比。(4)溶液pH。不定。4.方法学评价：灵敏度高、选择性好、取样量少，但干扰因素较多。5.临床应用：糖类、胺类、DNA与RNA酶与辅酶，Vit类及Ca2+、Fe3+、Zn2+等。(三)散射光谱分析法(比浊法)1.原理：利用光线通过混悬颗粒后产生的散射光谱特征，确定其性质…..2.类型：散射比浊法：根据光线通过混悬液后，光线减弱的程度来测定其浓度。不需特殊仪器。透射比浊法：速率和终点法。通过光线透过的强度来确定颗粒的浓度。需特殊仪器如激光比浊仪。3.影响比浊法测定的因素：(1)混悬颗粒大小；(2)颗粒形状；(3)混悬液的稳定性。因此，使用比浊法必须做到：(1)溶液中颗粒的分散度尽可能相同；(2)混浊液至少10min内保持稳定。4.临床应用：免疫球蛋白、载脂蛋白、补体、ASO、RF等。二、电泳技术(一)原理：利用带电粒子在电场中向所带电荷相反的电极移动的性能，对物质分子进行分析测定。(二)电泳技术的分类与特点1.移动界面电泳(movingboundaryelectrophoresis)：已淘汰。2.区带电泳(zoneelectrophoresis)：一类是滤纸、醋酸纤维素膜、硅胶等；一类是淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。其中后者的优点是：(1)使用细微多孔网状结构支持介质，可消除电荷效应、分子筛效应使分辨率提高；(2)几乎不吸附蛋白质，电泳无拖尾现象；(3)蛋白质在低浓度琼脂糖胶电泳时可自由穿透，阻力小，透明度高，敏感性高。因此，取代第一类电泳。CONTINUE(三)方法学评价设备简单，操作方便，具较高的分辨率及选择性，不足之处是干扰因素较多。(四)电泳技术的影响因素颗粒性质，电场强度，溶液性质，pH值，离子强度，溶液粘度，电渗和支持物等。(五)区带电泳的临应用测定项目有：血清蛋白、血红蛋白、糖化血红蛋白、脑脊液和尿液蛋白、脂蛋白及脂蛋白(a)、LDH、ALP、CK的同工酶及亚型。毛细管区带电泳可分离的项目包括：多肽、氨基酸、DNA、酶分子等。研究热点。四、层析技术(一)原理：利用固定相和流动相理化性质的差异而建立起来的分析技术。当流动相(待分离物质)经过固定相时，由于各组分的理化性质差异，与两相发生相互作用(吸附、结合)的能力不同，在两相中的分配不同，随着流动相的推进，各组分在两相中进行不断再分配。与固定相作用弱的组分，受到阻力小，向前移动速度快，反之，移动速度慢，从而达到将样品中各单一组分分离的目的。(二)层析技术的类型：1.按两相所处状分：液-液层析法、液固层析法、气-液层析法、气-固层析法2.按操作模式不同分：柱层析法、薄层析法、纸层析法、薄膜层析法3.按层析原理分：吸附层析法---固定相是固体吸附剂分配层析法---固定相是静止的液体CONTINUE离子交换层析法------固定相是离子交换剂凝胶层析法------固定相是多孔凝胶亲和层析法------固定相可以是固体、液体或凝胶，但只能与一种待分离的成份专一结合。(三)层析法的特点及应用层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，故适用于杂质多，含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。具体如下：1.凝胶层析法(1)特点：固定相为惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，对分离成分理化性质的保持有独到之处。(2)应用：脱盐；分离提纯；测定高分子物质的分子量；高分子溶液的浓缩。CONTINUE2.离子交换层析法以具有离子交换性能的物质作固定相，利用流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。临床应用于分离氨基酸、多肽、蛋白质及同工酶等。3.高效液相层析法(highperformanceliquidchromatography)(1)优点：分离能力强，测定灵敏度高，强在室温下进行，应用范围极广。(2)HPLC的类型：液-固吸附层析；液-液分配层析；离子交换层析。(3)临床应用：多用于蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和脂类等的分离。4.亲和层析法利用待分离物质与配体间所具有的特异性亲和力，达到分离目的一类特殊层析技术。如抗原与抗体、DNA与RNA、酶与底物或抑制物等。主要用于纯化生物分子。五、电化学分析技术(一)定义：利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量变化的方法。包括电位分析法(potentialmethod)、电导分析法和电容量分析法等。电位分析法：是利用电极电位和浓度之间的关系来确定物质含量的分析方法。而离子选择性电极分析法(ionselectiveelectrode，ISE)则是电位分析法中发展最为活跃的分支。(二)离子选择性电极法的电极类型1.玻璃膜电极如H+、Na+等。2.气敏电极3.酶电极(enzymeelectrode)(三)临床应用用在电解质分析仪上，测定K+、Na+、Cl-、Ca2+等。第三节生物芯片和生物传感技术一、生物芯片技术生物芯片(biochip)是指由微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建而成的微型生物化学分析系统。其特点是高通量、微型化和自动化，可以对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。二、生物传感技术生物传感技术(biosensor)是由生物活性材料与相应的换能器结合而成的结合体，能测定多种特定的生物化学物质。一、生物芯片技术(一)原理：把制备好的生物样品固定于经过化学修饰的载体上，样品中的生物分子与载体表面结合(保留其理化性质)，在一定条件下，与芯片上的生物分子发生反应，并使反应达最佳状态，然后利用芯片专用监测系统对芯片信号进行监测，即可高效、大量获取待检物质的信息。(二)生物芯片类型按固定的生物分子及材料不同可分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片和芯片实验室等。其中临床生物化学常用的有基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室三类。1.基因芯片(genearrays)是通过检测基因的丰度来确定基因的表达模式和表达水平。2.蛋白质芯片(proteinarrays)，指把制备好的蛋白质样品固定于经过化学修饰后的玻片、硅片等载体上，蛋白质与载体表面结合，但仍保留蛋白质的理化性质和生物活性的分析系统。CONTINUE3.芯片实验室(lab-on-chip)是指将生物化学实验室的分析功能浓缩固定在生物芯片上所形成的分析系统。(三)生物芯片技术要点1.芯片制备常用的芯片基底(即芯片载体)是玻璃片和硅片。制芯片过程有：(1)首先利用表面化学方法或组合化学方法对芯片基底(载体)进行处理(修饰)；(2)然后将蛋白质分子(纯化后的)按顺序排列在芯片上。主要是利用自动点样装置将不同的蛋白质固化在载体的表而，用这种装置，半块载玻片就可固定10000多种蛋白质。点样的关键是既要保证芯片载体上的蛋白质分不失活，又要能够牢固的固定在载体表面。根据对芯片载体的处理方法，芯片可有以下几种类型：蛋白质微陈列芯片----用于研究蛋白质；微孔板蛋白质芯片；三维凝胶块芯片---用于研究抗原抗体、酶动力学。CONTINUE2.样品的制备(1)首先利用同位素标记法、或酶标记法或荧光标记法对待测样品进行标记；(2)然后通过在芯片上制作的微型样品处理系统(如介电电泳)，将标记的待测样品从复杂的混合体中分离出来。3.生物分子的反应选择合适的反应条件，如温度、pH、抗体浓度等使生物分子之间的反应处于最佳状态，以提高检测的灵敏度和特异性。反应类型如抗原抗体反应、受体配体反应、DNA与互补DNA或RNA的反应、酶与底物或抑制剂的反应等。4.芯片信号的检测(1)芯片专用监测系统，scanArray5000;(2)全自动免疫分析仪，用于监测微孔板蛋白质芯片。(四)生物芯片技在医学中的应用1.用于临床疾病的诊断：如肿瘤、糖尿病、传染性疾病等。CONTINUE2.基因排序分析3.药物筛选：从蛋白质水平或基因水平寻找药物靶标，解释药物的作用机制。(五)蛋白质芯片技术与传统的质谱和双向凝胶电泳技术相比，优点：1.能够快速定量分析大量的蛋白质。2.操作较简单，只须标本进行沉降分离后，就可加在芯片上进检测分析。3.样本用量少，结果正确率高。4.与酶标ELISA相比，蛋白质芯片采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好。5.所需试剂少，实用性较强。二、生物传感技术(一)原理：待测物质分子经扩散作用，进入固化生物敏感膜层，发生特异的生物化学反应，产生的信息被相应的物理或化学换能器转变成可定量或可处理的电信号，再经过2次脉冲放大输入到计算机系统，就可算出待测物的浓度。1.生物敏感膜又称为分子识别元件。是采用固定化技术将酶等生物活性物质限制在一定的空间，而又不妨碍它们自由扩散的人工膜。固化生物活性物质与游离相比优点有：(1)热稳定性提高；(2)可重复使用；(3)不需要在反应后进行催化物质与反应物的分离；(4)可根据已知的halflife来确定生物膜的寿命；(5)能够避免外源性微生物对生物功能物质的污染和降解等。2.生物学反应和换能器CONTINUE(二)生物传感技术的分类1.按分子识别元件的不同可分为：酶传感器(enzymesensor)、微生物传感器(microbial)、免疫传感器(immune)、组织传感器(tissue)和细胞器传感器(organell)2.按所用换能器不同分为：生物电极、半导体生物传感器、光生物传感器(opticalbiosensor)、热生物传感器、压电晶体生物传感器。3.目前流行的分类法：微型生物传感器--用于活体测定亲和生物传感器------免疫电极、酶电极多功能生物传感器-----血液成分传感器杂合型生物传感器------多酶传感器(三)生物传感器技术的应用1.酶电极如GOD电极、BUN电极等。CONTINUE2.杂合生物电极如可用pH电极测TG，H2O2敏感双酶电极测CHO3.热生物传感器(四)生物传感技术的进展1.传感器功能方面的进展。如以微型计算机为主体的传感系统。2.传感器类型方面的进展。出现了以新原理、新配件的传感器。如导纳生物传感器(admittancebiosensor).3.传感器向微型化、集成化和智能化方面发展。