临床生物化学常用技术

1临床生物化学检验常用技术第3章2本章主要内容①光谱检验技术②电化学分析技术③电泳技术④干化学技术⑤PCR技术3教学目标和要求掌握光谱分析中的对比法、摩尔吸收系数法、比浊法测定的方法原理，在生化检验中的应用及注意事项；区带电泳的原理、应用及影响因素；离子选择性电极法测定的原理和注意事项。熟悉离心技术，其它电泳技术和层析技术中的HPLC及亲和层析的原理和应用；免疫分析技术、生物传感技术的概念和应用原理。了解色谱、层析等常用生化技术的应用原理和方法，生物芯片技术的概念和应用原理。4第一节光谱分析技术分光光度技术的基本原理分光光度计的基本结构分光光度计的操作方法分光光度技术的定性和定量方法5光的本性光的描述：波长和能量可见光：400nm~760nm紫外光:200nm~400nm红外光:760nm~1000nm6光谱分析技术原理：利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法散射光谱分析技术：比浊法7一、分光光度技术的基本原理（一）吸光度与透光度A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：T=I/I0T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：8（二）Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为：A=KLC式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）9吸收曲线（Ａ－Ｃ曲线）０１２３４ＣＡ1.00.80.60.40.2Y=ax+b10吸光系数的应用１、定性２、判断方法的灵敏度３、定量测定物质浓度11偏离朗伯比耳定律的因素?1、光学因素2、化学因素3、为什么有的分光光度计使用双波长或双光束？12分光光度法的结构①光源及光源要求波长的选择原则:可按“吸收最大，干扰最小”的原则进行。2、单色器3、比色杯及要求4、检测器与显示器13分光光度计的使用1、开启电源，将比色池盖打开，通电20分钟预热2、调节波长3、将空白液、标准液及样品液置于光路4、空白调节T为0、100%5、调A为06、重复4和57、测量标准和样品吸光度。14（二）吸光度的校正铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。15四、分光光度技术的定性和定量方法（一）分光光度技术的定性方法定性依据：最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε2.摩尔消光系数ε方法1.最大吸收波长λmax方法16（二）分光光度技术的定量方法1、对比法1、将已知浓度的标准品和待测溶液有同一方法、在相同条件下同时进行测定。2、当标准液与标本用量可能不同时的测定。标准液的要求：其浓度尽量接近于样品浓度。（双标准）17（二）分光光度技术的定量方法2.标准曲线法用途：1、确定分析范围2、减少系统误差3、比较方法的灵敏度18根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。方法：19作图法的步骤1、制备标准液2、显色反应3、比色4、作图5、制作检量表。20标准曲线00.51020406080100浓度吸光度将一系列浓度不同的标准溶液按照、一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度，即标准曲线法。标准曲线法21制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1）浓度范围足够大（2）减少偶然误差（3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。（5）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。（6）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。22第二节电化学分析技术电化学法概述电化学分析：利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法。主要有：电位法、电导法、电容法。23电位分析法基本原理电位分析法是利用电极电位和浓度之间关系来确定物质含量的分析方法。电极电位由能斯特方程式确立。电极电位测定是通过构建原电池电动势，其中一个电极的电位随待测离子尝浓度改变而改变（指示电极）；另一电极电位不受试液影响（参比电极），通过测定原电池的电动势便可求得待测离子浓度。24Nernst方程。其方程式为：02.303logFiRTEEanF′R为气体常数、T为绝对温度、n为离子电荷数、F为法拉第常数a为被测离子活度25一、离子选择电极法的原理离子选择电极分析法（ionselectiveelectrode，ISE）是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子活度的一种电化学分析法。ISE法的核心是指示电极上带有对被测离子选择性响应的敏感膜，膜的一面与被测离子的溶液相接触、另一面则与电极内所充的一定活度的被测离子溶液和内参比电极接触，膜内外的离子活度的差异引起离子从高浓度向低浓度迁移，从而产生电位改变，其数值可在等电流的条件下测定。26离子选择性电极结构2728ISE的特点①选择性好:多数情况下共存离子的干扰小，组成复杂的试样往往不需分离处理即可直接测定；②灵敏度高：可达10-5～10-8mmol/L,线性范围宽，Na+为10-6～10-1mmol/L，K+为310-5～1mol/L，氯为510-5～1mol/L，Ca++为310-5～1mol/L；③溶血、脂血及黄疸不影响测定，对有色、浑浊溶液都可进行分析；④设备简单，分析速度快，易于自动化，标本用量少，应用范围广。29离子选择电极分析方法1、标准曲线法2、标准比较法3、标准加入法（消除基质效应）样品测定方式：直接法与间接法30三、离子选择性电极法测定的影响因素1．离子强度2、温度3、PH值4、共存离子的干扰31Attention!电解质分析仪一般要求24小时开机，目的是为了保持电极膜很好的水化，增加电极的稳定性。经常关仪器，使得电极膜干燥，会加速电极膜的失效和产生测定中的漂移。仪器正常启动后，清洗管道，进行两点校准，每隔2小时自动单点校准。每天用后进行电极保养，去除附在电极膜上的蛋白质。32第三节干化学分析技术一、干化学分析原理1、反射光度法Kubelka-Munk理论：光反射率与固相层的厚度、单位厚度的光吸收系数以及固相反应层的散射系数有关系，当固相层的厚度和固相反应层的散射系数固定时，光吸收系数与待测物的浓度成正比。33干化学的原理（1）试剂结构Sample反射层清除剂层支持层样本扩散层试剂层34二、分析原理（一）分析过程1．样本扩散层待测样品定量加到干片试剂，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。2、反射层光漫射层，为光检测提供一个具有反射的背景。3、清除剂层：清除血清中内源性干扰物354．试剂层样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反应。试剂层的结构还能控制多步化学反应的反应次序。支持层为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。36干化学的原理（3）比色样本扩散层反射层清除剂层支持层接收器37干化学分析技术的影响因素仪器监测：标准灰色试剂条/校准条校准频度：每6个月校准一次，质控经常做质控物：用干化学分析仪生产厂家提供干片试剂的储存与使用：0℃保存，平衡后用工作环境与温度：15~30℃，湿度85%38第四节电泳分析技术39一、电泳技术的原理及其影响因素1．原理：带电粒子在电场中的移动现象称为电泳(Electrophoresis)。带负电荷的粒子向电场的正极移动；带正电荷的粒子则向负极移动。各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可以对物质进行分离和鉴定。40电泳两端的端电压差电场强度两端间的距离2．影响颗粒电泳迁移率的因素电泳迁移率？1、分子形状体积大者慢，小者快2、E↑v↑Q↑E↓V↓扩散明显、区带模糊、分辨率下降413、缓冲液（1）缓冲溶质性质稳定，缓冲容量大、电导低、离子移动好（2）pH影响分子电荷性质和电量(3)离子强度（I）影响缓冲容量、速度和产热效应I↑、pH稳定、速度慢、产热多、时间延长、扩散I↓、pH不稳定、速度快、产热少；区带不整齐、分辨率下降424、支持介质吸附作用：支持介质对标本的吸附作用吸附作用使电泳速度减慢，出现拖尾现象。电渗：电场中液对固相的相对移动电渗只影响电泳速度，不影响分辨率43蒸发：支持介质水份的蒸发导致缓冲液浓缩，离子强度增加，标本分电流减少，电泳速度减慢；虹吸作用，使标本区带向中间集中并弯曲，导致分辨率下降。（所以，电泳时电泳槽要密闭）44二、电泳类型及应用电泳的分类方法很多，在这里电泳原理将电泳分离系统分为1、移动界面电泳2、区带电泳3、稳态电泳45（一）.醋酸纤维素薄膜电泳（celluloseacetateelectrophoresis）醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化而形成的纤维素醋酸酯，由它制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。它具有分辨力好，对蛋白质吸附极少，拖尾现象轻微；不吸附染料，对区带周围的染料能完全洗去，不干扰测定；样品需要量少、介质又可以透明后定量扫描等优点。临床生物化学上分离血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、甲胎蛋白及同工酶等大分子物质。46缺点和注意事项：吸水性差，水份易蒸发。电泳槽要求密闭，维持水蒸气饱和电流强度不宜过大，0.4~0.6mA/cm宽。47（三）琼脂糖凝胶电泳概述：琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为支持介质的一项电流技术。常用于血浆脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和DNA酶切片断的电泳分离。48琼脂糖凝胶电泳优点电渗作用小吸附极微分辨率和重现性均较好适合分离大分子物质（分子筛效应）电泳图谱清晰便于扫描并可长期保存4950（二）.聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成三维网状结构的凝胶。51常用的催化剂有过硫酸胺和核黄素，加速剂一般用四甲基乙二胺。凝胶网状结构孔径的大小，决定于丙烯酰胺单体的浓度和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。52PAGE的三种效应1、标本浓缩效应2、电荷效应3、分子筛效应53电泳区带的测定方法分类：直接法：紫外光扫描区带，适用于透明介质染色法：染料染色后，洗脱背景可见光扫描54区带染色法蛋白质染料：丽春红、氨基黑10B、考马斯亮兰、溴酚兰、硝酸银。同工酶的染料：常使用乳酸脱氢酶（LDH）-辅酶（NAD+）-酚嗪甲酯硫酸盐（PMS）-NBT脂蛋白染料：苏丹红、苏丹黑，油红O核酸染料：溴乙啶55区带定量分析1、光密度扫描法2、洗脱比色法特殊电泳技术自动电泳分析56电泳的临床应用一、蛋白质电泳血清蛋白电泳免疫固定电泳脂蛋白电泳尿蛋白电泳二、同工酶电泳分析57肾小管性蛋白Proteinsoftublarorigin(70Kda)白蛋白Albumin(70Kda)肾小球性蛋白Proteinso