基因工程的操作过程

基因工程的操作过程C转化子的筛选和鉴定（检）B重组DNA分子的转化和扩增（转、增）ADNA的体外重组（切、接）基因工程的操作过程切接转增检重组率重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。重组率提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'p5'GCTTAAOH5'5'AATTCG5'HO退火5'G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶重组率提高重组率的方法加装同聚尾末端：CTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG3'GG3'GGGGGGACGTC5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowB重组DNA分子的转化和扩增（转与增）基因工程的操作过程转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是:Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的制备：100ml菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体用10ml冰冷的75mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液悬浮菌体冰浴放置12-24小时，备用收集菌体转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组冰浴放置半小时在42℃保温1.5分钟（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟DNA连接液，混匀加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选提高转化效率的几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量:所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制（过滤除菌，非高压灭菌），最好分装保存于干燥的冷暗处（冰箱4℃）。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选和鉴定带来不必要的麻烦。转化的原理与技术细菌原生质体的转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化转化的原理与技术细菌原生质体的转化不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液），并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。细菌原生质体的制备：转化的原理与技术细菌原生质体的转化取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20mlDNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀细菌原生质体的转化：细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素转化的原理与技术l噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选转化的原理与技术电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大转化率转化率的定义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）转化率转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低转化率转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高转化率转化率的影响因素转化方法方面：受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化0.1ml感受态细胞50ngDNA转化方法：Ca2+诱导转化106-107/mgDNA原生质体转化109个原生质体50ngDNA原生质体转化105-106/mgDNAl-DNA转染107-108/mgDNA电穿孔转化106-109/mgDNA转化细胞的扩增扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时原生质体转化后的再生过程l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作转化细胞的扩增扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定外源基因导入真核细胞的方法1．酵母的转化一般有以下两种方法：(1)利用酵母的原生质球进行转化首先，酶解酵母细胞壁，产生原生质球，再将原生质球置于DNA、CaCl2和多聚醇(如聚乙二醇)中，多聚醇可使细胞壁具有穿透性，并允许DNA进入。然后使原生质球悬浮于琼脂中，并使其再生新的细胞壁。(2)利用Li+盐进行转化这种方法不需要消化酵母的细胞壁，产生原生质球，而是将整个细胞暴露在Li+盐(如0.1mol／LLiCl)中一段时间，再与DNA混合，经过一定处理后，加40％PEG4000，然后经热应激等步骤，即可获得转化体。这种方法的主要缺点是，如果用自主复制的质粒进行转化，转化体的数目比用原生质球低10～100倍。2．植物细胞的转化及其他基因转移方法(1)叶盘法植物细胞转化常用的方法。先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。为了对叶盘进行接种处理，需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4～5min，然后用滤纸吸干，放在培养基上进行培养，需将叶子背面接触培养基。经过数周后，叶盘周围会长出愈伤组织并分化出幼苗。叶盘法的优点是操作简便、适用性广，对于那些能被土壤农癌杆菌感染并能从离体叶盘形成的愈伤再生成株的各种植物都适用。这种方法具有很高的重复性，便于大量常规地培养转化的植株。目前，这种方法已成为双子叶植物基因导入的主要手段。用这种主法所得到的转化体，其外源基因能稳定地遗传和表达，并按孟德尔方式分离。(2)电击法原理是，在强电压下，细胞膜会出现电穿孔现象。经过一段时间后，细胞膜上的小孔会封闭，恢复细胞膜原有特性。据此原理设计的电击法可用于基因转移。电击法具有简便、快速、效率高等优点，但在植物中，由于细胞壁对外源基因的摄取有不利影响，所以一般以原生质粒为受体细胞。目前，该法用于烟草、玉米、水稻、小麦、高梁和大豆等植物，已得到了稳定的外源基因表达。(3)基因枪法又称高速微型子弹射击法，它是将DNA吸附在由钨制作的微型子弹(直径约为1.2um)表面，通过特制的手枪，将子弹高速射人完整的细胞和组织内。用这种方法，已将DNA先后送人酵母的线粒体和核、衣藻的叶绿体和核、洋葱的表皮细胞以及玉米悬浮细胞中。基因枪法避开原生质体再生植株的难关，因此成为单子叶植物基因转移的有效途径。3．哺乳动物细胞基因导入法（1）磷酸钙沉淀法具体做法大致是：先将需要被导人的DNA溶解在钙盐溶液中，然后在不停地搅拌下逐滴加到磷酸盐溶液中，形成磷酸钙微结晶与DNA的共沉淀物。再将这种共沉淀物与受体细胞混合、保温，DNA可以进入细胞核内，并整合到寄主染色体上。这种方法多数用于单层培养的细胞，也可用于悬浮培养的细胞。(2)脂质体载体法这种方法即用脂质体包埋核酸分子，然后将其导入细胞。脂质体是一种人工膜，制备方法很多，用于转移DNA的较理想的膜成分是带负电荷的磷脂酰丝氨酸。做法大致是：将磷脂和DNA溶液溶解于大量的有机溶剂(如醚)中，再经过超声波处理，使其形成乳剂，然后蒸发掉有机溶剂，最终形成0.4um的脂质体，进一步可通过聚乙二醇(PEG)的作用，使细胞吸收脂质体。(3)显微注射法又简称为微注射法，它是创造转基因动物的有效途径。其技术关键如下：①理想外源基因的制备。这种基因可处于质粒上，但注射前质粒已经酶切而线性化。有的载体DNA会干扰外源基因的表达，因此注射前，需要先从载体上将它们切下。②收集受精卵。在受孕后的几小时内，父母双方的遗传物质还未结合前，从供体动物中取出单细胞的受精卵。③显微注射。利用极细的毛细玻璃管(外径为0.5—1um)，将理想的遗传物质注入受精卵的雄原核。这必须在父母双方遗传物质融合前的4h间歇期内完成。当双亲染色体相遇后，注入的理想基因有可能整合到染色体上。④在几次细胞分裂后，将带有理想基因的受精卵移入母体，使受精卵孕育。(4)DEAE葡聚糖转染技术二乙胺乙基葡聚糖（DEAE-dextran）是一种相对分子质量较大的多聚阴离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，因此被用于基因转染技术。其促进细胞捕获DNA的机理还不清楚，可能是因为葡聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，也可能是葡聚糖与细胞结合而引发了细胞的内吞作用。DEAE-dextran转染主要有两种不同的方法。一种是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA／DEAE-dextran复合物后，再用来处理细胞；另一种是受体细胞先用DEAE—dextran溶液预处理，然后再用来与转染的DNA接触。C转化子的筛选和鉴定（检