基因打靶技术

基因打靶技术叶亚新基因打靶研究背景基因转移技术显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的可能导致下面几种情况出现：①导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺失；②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；③外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；④导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。解决办法：将外源基因导入预先确定的位点。即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，什么是基因打靶？基因打靶（genetargeting）是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法建立在胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段基因打靶原理生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。同源重组(Homologousrecombination)又称一般性重组或非特异性重组(Generalrecombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程,外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。2020/2/7苏州科技学院生物系叶亚新基因打靶的原理基因打靶的主要步骤1.重组基因载体的构建2.导入受体细胞3.筛选4.检测基因打靶的主要步骤1.打靶载体的构建基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等。基因打靶载体：基因插入型载体(Gene-insertionvector)：插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。基因置换型载体(Gene—replacementvector)：置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。基因打靶的主要步骤2、外源DNA导人的方式外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最广的是显微注射法。显微注射每次只能注射一个细胞；电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES细胞稳定转染；逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。3.基因打靶的筛选方法（1）正负双向选择系统(positive-negative-selection,PNS)解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因常用HSV-tk基因，在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。3.基因打靶的筛选方法（1）正负双向选择系统(positive-negative-selection,PNS)无毒的丙氧鸟苷（GANC）毒性核苷酸杀死细胞筛选排除随机整合的细胞株。同源重组时，G418和GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。胸苷激酶蛋白（TK）2020/2/7苏州科技学院生物系叶亚新基因打靶的筛选3.基因打靶的筛选方法（2）正相选择法（positiveselectionmethod）主要程序：将标记基因neor的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染进靶细胞，可能出现下面几种情况：①打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失；②外源打靶序列随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始密码，整合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻；③虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达；④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶基因自然存在的启动子和起始密码的作用而呈现表达活性。因此，如用G418筛选，则抗性细胞中将只包含后两种可能情况，根据这两种情况下基因组DNA酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。4.基因打靶的策略•完全基因剔除(completeknotk-out)的策略•大规模随机基因剔除—基因捕获(genetrapping)•精细突变的引入•条件性基因打靶打了就走策略(HitandRun法)“标记和置换”法(TagandExchange)4.基因打靶的策略借助于阳性选择标记基因通常被插入靶基因功能最关键的外显子中，或通过同源重组删除靶基因最重要的功能域，实行靶基因的完全剔除。阳性选择标记基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），将其以正确的读框插入靶基因的外显子中，除了剔除靶基因外，通过分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表达的时空顺序。•完全基因剔除(completeknotk-out)的策略4.基因打靶的策略•大规模随机基因剔除—基因捕获(genetrapping)可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。但此方法的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。4.基因打靶的策略打了就走策略(HitandRun法)这一方法包括两次同源重组：第一步（Hit）用插入型载体进行同源重组，这样会在靶位点插入带有突变的基因组序列以及载体骨架，载体骨架上带有两个筛选标记（如正筛选标记基因neo和负筛选标记基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性筛选，富集为数不多的发生了染色体内重组的克隆。染色体内重组去除了含有负筛选标记基因的载体序列，由于负筛选标记基因的消失，细胞就恢复了对负筛选药物的抗性，因此，回复突变体可以在负选择培养基中存活下来。基因打靶技术的优点有待改进之处宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞能把外源基因引入染色体DNA的特定片段上，并可对宿主染色体进行精细改造新引入基因随染色体DNA的复制而稳定复制命中率低引入细胞核难度大非同源重组随机插入的干扰同源序列要求高对缺失染色体部分进行打靶无效