人工感染猪链球菌对小鼠肝脏药物代谢酶的抑制作用

中国农业科学2009,42(3):1078-1083ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.03.041收稿日期：2008-02-22；接受日期：2008-09-08基金项目：国家“973”项目子专题（G1999011906）作者简介：王丽平（1971－），女，内蒙古乌海人，副教授，博士，研究方向为兽医药理学及毒理学。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]。通信作者陆承平（1945－），男，上海人，教授，博士，研究方向为兽医微生物与免疫学。Tel：[phone]；Fax：[phone]；E-mail：[e-mail]人工感染猪链球菌对小鼠肝脏药物代谢酶的抑制作用王丽平，陆承平（南京农业大学动物医学院，南京210095）摘要：【目的】评价猪链球菌感染对小鼠肝脏药物代谢酶活性的影响。【方法】120只雄性ICR小鼠，随机分为对照组和2个感染组，后者分别人工感染猪链球菌2型强毒力株HA9801和弱毒力株SS2-H，于感染不同时间测定小鼠体内肝脏药物代谢酶活性的变化。【结果】感染HA9801菌株的小鼠，细胞色素P450（CytP450）、细胞色素b5（Cytb5）、NADP-细胞色素C还原酶（NCCD）活性从第3日开始极显著（P＜0.01）或显著(P＜0.05)降低，第10日时降至最低（NCCD于第5天时最低），第15日时活性有所增强，但仍显著低于对照组；红霉素-N-脱甲基酶（ERND）活性从第5日开始极显著地降低（P＜0.01），变化趋势与CytP450、Cytb5相似；氨基比林-N-脱甲基酶（AND）活性虽有变化，但与对照组比较，差异不显著（P＞0.05）；苯胺-4-羟化酶（AH）活性在第10日时开始极显著地下降（P＜0.01），第15日时稍有上升。感染SS2-H的小鼠，CytP450、Cytb5的活性从第5日开始显著降低(P＜0.05)，第10日降至最低；NCCD、ERND和AH活性第10日时显著降低(P＜0.05)，而AND活性在感染期间未发生显著变化（P＞0.05）。HA9801感染组与SS2-H感染组小鼠的谷胱甘肽巯基转移酶（－GSH-S-T）活性从感染后第3日开始即显著(P＜0.05)降低。HA9801感染组与SS2-H感染组比较，CytP450、Cytb5活性在感染前期均有极显著（第3日、第5日）差异（P＜0.01），而在感染后期，差异不显著（P＞0.05）。微粒体蛋白浓度各组差异不显著（P＞0.05）。【结论】猪链球菌感染可调节小鼠肝脏药物代谢酶CytP450、Cytb5、NCCD、ERND、AH和GSH-S-T活性，故在感染期间选择药物进行治疗时，应制定合理的给药方案，避免药物毒性反应产生，加重病情。关键词：猪链球菌2型；肝脏药物代谢酶；肝微粒体蛋白；药物毒性InhibitionofHepaticDrug-MetabolizingEnzymesinMiceDuringStreptococcussuisType2InfectionWANGLi-ping,LUCheng-ping(CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095)Abstract:【Objective】TheeffectofStreptococcussuisinfectiononbothphaseI(oxidative)andphaseII(conjugative)microsomalenzymeactivitieswasinvestigatedinawell-characterizedmiceinfectionmodel.【Method】OnehundredandtwentyICRmousewereusedanddividedrandomlyintoinfectiongroups(HA9801groupandSS2-Hgroup)andnegativecontrolgroup.Eachinfectedmousewasinoculatedintraperioneallywithonemlinoculumcontaining1/2LD50ofeachstrain.Onecontrolgroupofmicewasinjectedwithonemlofsterilewater.Bodyweightwereweighedeverydayandthelevelsoflivermicrosomalprotein,activitiesofcytP450,cytb5,NCCD,ERND,AND,AHandGSH-S-Tweredeterminedon3,5,10,15days,respectively.【Result】IntraperitonealinjectionofStreptococcussuisresultedinatime-dependentmodulationofhepaticdrug-metabolizingenzymesactivitiesinmice.Theactivitiesofsomedrug-metabolizingenzymesofinfectedgroupsweresignificantlyloweredcomparedwiththenegativecontrolgroupduringdifferentinfectiousdays,especiallyon10daypost-infection,thelowestlevelsofcytP450,cytb5,NCCD,AHandERNDwereachieved.Whilebetweenthetwoinfectedgroups,therewasnoobviousdifferenceinthelevelsofalltheenzymestestedexceptthelevelsofcytP450andcytb5attheearlystage.【Conclusion】ThepresentstudyisthefirsttoshowthattheinfectionbyS.suiscandecreasetheactivitiesofsomehepaticdrug-metabolizingenzymesinmice.Ifsucharesponsealso3期王丽平等：人工感染猪链球菌对小鼠肝脏药物代谢酶的抑制作用1079occursinhumans,thishasthepotentialtoproduceseriouscomplicationswithdrugandendogenoussubstratemetabolisminpatientswithaninfectiousdisease.TheresultsalsosuggestthatdrugswithnarrowtherapeuticindicesaredangerousduringtherapeuticscheduleandshouldbeadministeredwithcautionduringinfectiousdiseasescausedbyS.suisorotherbacteriaandviruses.Keywords:S.suis;drug-metabolizingenzymes;livermicrosomalprotein;drugtoxicity0引言【研究意义】猪链球菌感染小鼠后，肝药酶活性会发生什么变化，目前临床中未有研究。本研究将阐明猪链球菌2型感染小鼠后对其肝药酶活性的影响，探讨宿主与猪链球菌之间的相互关系，为临床开展猪链球菌病药物治疗，降低由于药物之间相互作用而造成的不良反应提供依据。【前人研究进展】肝脏是机体药物代谢的主要场所，对药物或外源性毒物的代谢和处置起着重要作用，尤其肝微粒中含有催化Ⅰ相、Ⅱ相反应的各种酶系，参与大多数药物和外来化学物的代谢，在调节机体与外界环境的相互作用以及保持机体的稳态中起着十分重要的作用。该酶系的活性，可受遗传、年龄、机体状态、营养、疾病等多种因素影响，肝脏药物代谢酶的活性被诱导或抑制后，可影响该酶系对特定底物在体内的解毒代谢和活化代谢间的平衡，从而导致临床药物相互作用[1-2]，故具有重要的生理意义。除了药物对酶活性有较大的影响外，已有研究表明，感染性疾病已越来越成为影响肝脏药物代谢酶活性的重要因素，病毒、寄生虫、细菌的感染会对机体肝脏药物代谢酶产生诱导或抑制作用[3-7]。大量研究已表明许多细菌在造成机体感染期间可影响肝脏药物代谢酶的活性。Armstrong等[8-9]的研究结果表明：鼠感染李氏杆菌后，由于李氏杆菌溶血毒素的释放可抑制肝脏药物代谢酶的活性，并使药物的消除受到影响。Khatsenko等[10]的结果显示：沙眼衣原体感染小鼠6d后即可抑制肝脏CYP1A和CYP2B的活性。Monshouwer等[11]对感染放线杆菌的猪进行研究，发现病猪肝脏中不同亚型的CPY的活性均有下调的现象，对药物的消除产生很大影响。上述细菌的感染虽未造成严重的肝脏损害，但由于一些细菌在生长繁殖过程中所生成的毒素，例如棒状杆菌毒素[12]、葡萄球菌肠毒素B[13]、百日咳波氏菌毒素[14]及大肠杆菌内毒素[15]等均可抑制CYP活性。【本研究切入点】以感染猪链球菌2型菌株的ICR小鼠为研究对象，检测小鼠肝脏中代表性的药物代谢酶如：细胞色素P450（CytP450）、细胞色素b5（Cytb5）、NADP-细胞色素C还原酶（NCCD）、红霉素-N-脱甲基酶（ERND）、氨基比林-N-脱甲基酶（AND）、苯胺-4-羟化酶（AH）和谷胱甘肽巯基转移酶（GSH-S-T）活性的变化。【拟解决的关键问题】为治疗猪链球菌感染而选择有效、低毒的药物提供依据。1材料与方法1.1主要药品及试剂氨基比林（夏斯生物技术公司），红霉素（进口分装，上海华舜生物工程有限公司），Tris、考马斯亮蓝G-250（进口分装，国药集团），牛血清白蛋白（分析纯BR，国药集团），NADPH（Roche公司），细胞色素C（Sigma公司），其余试剂均为国产化学试剂，分析纯AR。1.2菌株猪链球菌2型菌株HA9801，SS2-H，1998年分离自江苏，由南京农业大学动物医学院微生物教研组保存。HA9801致病力较强，其毒力表型为MRP+EF+CPS+，而SS2-H致病力较弱，其毒力表型为MRP+EF+CPS-。1.3动物清洁级ICR成年小鼠120只，雌雄各半，体重18～20g，购自南京中医药大学实验动物中心，动物合格证号为scxk（沪）2003-0003，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2002-0123。所有小鼠于该实验动物中心适应饲养1周后用于试验。120只小鼠随机分为3组，每组40只，雌雄各半。1.4小鼠攻毒选取2型猪链球菌HA9801、SS2-H菌株，以各菌1/2LD50的剂量腹腔注射感染ICR小鼠，每组40只，同时设空白对照组。记录小鼠感染后症状，并分别于感染后第3、5、10、15天各取5只小鼠，断头处死后，肝脏无菌采样进行病原分离鉴定，然后制备肝微粒体。1.5肝微粒体悬液的制备参考文献[16]采用差速离心法制备。小鼠处死前一天禁食，但自由饮水。断头处死小鼠，迅速剖开腹腔（肝脏采样进行病原分离鉴定）和胸腔，剪去心脏，用注射器吸取预冷的生理盐水从门静脉灌洗肝至呈土黄色，以去除血红蛋白的干扰。取下肝脏，用预冷生1080中国农业科学42卷理盐水洗净、滤纸擦干、称重，于玻璃匀浆器中匀浆，按1﹕3（W/V）的比例加入预冷TMS缓冲液制成匀浆液。4℃、12000g/min离心20min，小心取出全部上清，于4℃、100000×g超速离心60min，弃去上清，沉淀用KCl磷酸盐缓冲液（0.15mol·L-1KCl，0.1mol·L-1PBS，pH7.4）重新悬浮后再超速离心60min，粉红色沉淀用含25