植物组织培养脱毒技术

第六章植物组织培养脱毒技术全世界已发现植物病毒近700种。大多数农作物，尤其是无性繁殖的家作物都受到一种或一种以上病毒侵染，且带毒株率高。病毒对寄主植物可造成灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。潜隐性病毒侵染植物造成症状不明显的慢性危害，不易被发现，尤其危险。受病毒侵染的植物全身终生带毒，目前尚无药物可治愈。国内外解决这一问题的有效途径是培育无病毒苗，实施农作物无病毒化栽培。第一节常见植物病毒及其症状一种病毒可侵染许多植物，而同种植物又可被许多病毒侵染。植物病毒对农作物的危害可使农业生产受到巨大的损失。在一年生种子繁殖作物上，可以采取一些预防措施，减轻当年病害的发生程度，一般不影响下一季的发病。木本植物一旦发病，以后连年都发病。营养繁殖的作物如马铃薯，番木瓜，草莓等，连年种植可以积累多种病毒侵染。马铃薯的退化，就是由多种病毒引起的。一、植物病毒的发现很多植物体内都带有植物病毒，由于人类视觉所限，形体越小的生物就越不易被发现，所以病毒的发现比其它生物要晚得多。直到19世纪末期，德国的A．Mayer发现烟草上出现深浅相间的绿色条纹，称之为烟草花叶病，并证实其具有传染性；后经俄国植物病理学家D．Ivanowski对烟草花叶病病原进行研究，认为它是由一种极小的“细菌”引起的；最终由荷兰人M．W．Beijerinck首先提出烟草花叶病病原是一种“传染性的活性液体”或称“病毒”。此后，许多学者陆续发现了各种植物病毒。1935年美国人Stanley和Bawden揭示了烟草花叶病毒的化学本质不是纯蛋白而是核蛋白；1940年德国的Kausche等首次在电镜下视察到烟草花叶病毒的杆状外形。由此，病毒研究进入了更深入的领域。目前，人们不但能在实践生产中有效地防治病毒的侵染，而且能利用病毒作为遗传工程的载体改造植物。二、植物病毒的类型植物病毒大部分属于单链RNA病毒，少数为DNA病毒。其基本形态有杆状、丝状和等轴对称的近球形二十面体。植物病毒虽是严格的细胞内寄生物，但专一性并不强，往往一种病毒可寄生在不同种、属甚至不同科的植物上。如烟草花叶病毒能侵染十多个科，200多种草本和木本植物。已知的植物病毒种类有600多种，绝大多数种子植物易发生病毒病。植物被病毒感染后，一般表现出三类症状：①因寄主细胞的叶绿素或叶绿体被破坏，使植物出现花叶或黄化病症。②阻碍植株发育，使植株发生矮化、丛枝或畸形等。③杀死植物细胞使植株出现枯斑或坏死。三、植物病毒对植物的侵染途径由于植物病毒一般无专门吸附结构，而且植物细胞表面至今也未发现有病毒特异性受体部位，因而植物病毒的侵染途径主要是通过伤口。如：①借昆虫刺吸式口器损伤植物而侵入细胞。②借带病汁液与植物伤口相接触而侵入。③借人工嫁接时的伤口而侵入。植物病毒侵入植物细胞后，病毒按其各自的核酸类型进行复制。其增殖过程因病毒类型不同其细节也很不相同，但步骤大致相似。四、植物病毒病的防治目前防治植物病毒病的基本策略是：防重于治和综合防治。一般采取以下措施：1、选育抗病品种选育病毒不能侵入或即使侵入也无法复制的抗病品种和对病毒感染有较强适应性的耐病品种。2、消灭传毒昆虫利用化学农药、生物农药或物理诱捕等方法治虫。3、用无性繁殖法培育无毒苗利用植物茎尖生长点并结合热处理（35～40℃）和组织培养的方法得到无毒苗。此法在防治马铃薯、葡萄、柑桔及某些观赏植物的病毒病方面十分有效。4、接种弱毒株来保护植物这是一种“给庄稼种牛痘”的方法。目前在许多国家已可用此法来预防蕃茄花叶病，用于其他植物病毒的弱毒株也在实验之中。5、采用合理的栽培措施等五、植物病毒的症状植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物上由病毒引起外部症状主要有以下几种：（1）变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有；香石竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。（2）坏死：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、条斑‘条纹等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑点病毒草等。（3）畸形：植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、蕨叶等病状。（4）萎蔫：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏而发生供水不足所出现的凋萎现象。第二节脱毒材料的获取目前在生产上常用的脱毒材料获取方法主要有：热处理脱毒、茎尖脱毒、抗病毒药剂脱毒等。此外，也有人通过愈伤组织、花丝组培等方法获取无毒植株。一、热处理脱毒带毒植株经高温处理后，病毒浓度会降低。通常处理方法是：把适当的材料移入一个热处理室或光照培养箱中，在35~40℃高温下，根据种类特征和材料情况处理数天到数周不等。如香石竹在38℃连续处理2个月，消除了茎尖内所有病毒。百合、郁金香、，风信子等球根花卉，用休眠种球进行热处理，可大大降低种球生长点内的病毒含量。热处理有一定的局限性，一方面热处理只能降低植株内病毒的含量，单独处理难以获得无毒材料；另一方面热处理时间过长，会造成植株代谢紊乱，加大品种变异的可能性。生产上通常采用热处理结合茎尖培养的脱毒方式，获得较高二、茎尖脱毒研究表明，茎尖和根尖的分生组织中一般是无毒或仅含极低浓度的病毒粒子。茎尖由顶端分生组织及其下的1～3个叶原基构成。一般大小在0.1～1㎜之间.茎尖脱毒主要包括表面灭菌、茎尖剥离、茎尖培养等步骤。香石竹脱毒的具体操作过和如下：（1）热处理将盆栽植株或离体瓶苗，在36～38℃下处理2周，或每天在36℃16小时和38℃8小时处理共30天，光照为3000lx。（2）表面消毒选取盆栽香石竹植株叶腋间生出的侧芽为外植体，先用自来水冲洗半小时，用75%的酒精消毒30秒，再用2.5%次氯酸钙或次氯酸钠溶液处理15分钟,取出后用无菌蒸馏水清洗4次,用无菌滤纸吸去多余水分备用。（3）茎尖剥离在双筒解剖镜下。切除叶片使芽体暴露，用解剖针剥掉幼叶，直到只剩下2个最幼小的叶原基。（4）茎尖培养用小刀片切下茎尖放入培养基。培养条件为25℃，光照16小时，光照强度为2000lx，平均两周进行一次转接，5～7周可获得单个小植株。三、抗病毒药剂处理脱毒用于植物脱毒的抗病毒药剂主要包括嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等。近年来，在脱毒生产中，经常采用且效果较好的抗病毒药剂是病毒唑。通常病毒唑在培养基内浓度为5㎎/l，处理时间4周后，生长锥中已无病毒，合适的茎尖大小是关键，1㎜长的茎尖，脱毒率为80%。第三节脱毒苗的检测经过脱毒处理的植株作为无病毒原原种或原种使用之前，必须针对特定的病毒进行检测，才能保证组培苗的内在质量。目前常用的植物病害检测方法有可见症状鉴定、寄主鉴定、抗血清检测、电镜检测、分子检测等。可见症状鉴定法较简单，但准确性差，对于不表现楞见症状的隐症病毒几乎无效；而电镜检测、分子检测虽然准确性高，但设备昂贵。目前生产上，国内外主要采用鉴别寄主和抗血清检测法检测植物病毒。一、鉴别寄主检测法1、鉴别寄主的栽种在隔离的温室内，通常在植株第4～6叶完全长开后，就可以接种。2、接种方法汁液涂抹法和小叶嫁接法3、症状观察接种后4天，注意观察症状的发展。二、抗血清鉴定法1、叶绿体凝聚法2、块茎沉淀法3、环形接口法4、酶联免疫法