人类重要传染病病原体耐药机制的基础研究

项目名称：人类重要传染病病原体耐药机制的基础研究首席科学家：王明贵复旦大学起止年限：依托部门：教育部一、研究内容拟解决的科学问题：鉴于我国在重大传染病的分子传播规律、耐药产生机制研究上的滞后，本课题所要解决的关键科学问题是：建立系统的耐药病原体分子监测网络与完整的反映中国耐药情况的耐药基因谱，系统地了解新耐药基因或耐药位点的产生与演变规律，明确主要耐药机制，获得治疗重要传染病耐药的新途径。1.建立系统的耐药病原体分子监测网络与完整的反映中国耐药情况的耐药基因谱：分子流行病学作为一种新的研究方法研究传染病病原体的传播规律，在西方发达国家已经广泛应用，并已经取得很好的成果。但是病原体流行病学的传播规律因地而异，国外的研究成果不能完全适用于我国，解释我国的传染病病原体及其耐药性的流行情况，更不可能用于指导我国传染病及其病原体耐药性的防治工作。因此，建立我国耐药菌的分子耐药监测平台，应利用现代分子流行病学的手段，研究我国耐药病原体的产生机制与传播规律，在此基础上建立耐药传播的预警机制与控制策略。2.系统地了解新耐药基因或耐药位点的产生与演变规律，明确主要耐药机制：①细菌方面，着重研究近年来新出现的严重的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的形成机制，近年来新发现的大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药的质粒介导耐药机制、ESBL编码基因的来源及传播机制，这些内容在国际上均尚未进行深入研究。②我国耐药结核分枝杆菌新耐药基因变异位点研究，对新耐药机制进行深入的研究，指导我国耐药结核分枝杆菌感染的诊断与防治。在上述分子流行病学及耐药机制研究的基础上，应用分子生物学信息技术，直接从临床标本中检测细菌及结核分枝杆菌，同时检测其耐药性。大大缩短病原体及其耐药性的病原诊断时间，指导临床及时、有效地选用药物。③HBV耐药机制的研究包括HBV对核苷类耐药规律、宿主因素对治疗效果的影响及HBV新突变株生物学特性的研究，建立可靠的HBV体外监测系统。④HIV耐药基因突变与耐药特性间的定性和定量关系，耐药的生物学特性，为建立使用高灵敏度、高通量的基因型测定准确预测耐药特性提供依据，同时对抗HIV靶位－HIV逆转录酶结构和功能的进行研究。3.获得治疗重要传染病耐药的新途径：耐药病原体感染的治疗措施有限、病死率高，通过耐药真菌新药靶的筛选及新型药物的筛选、抗菌药物防突变浓度研究、抗病毒药联合抗HBV等研究，探寻对付耐药病原体的新途径。开展耐药HIV病毒与相关细胞因子并重的结构生物学研究，以侧重病毒分子变异能力以外的机制包括细胞靶位的新路线解决HIV耐药的新途径。本研究的最终目标为阻止或延缓传染病病原体耐药性的产生及传播，有效治疗耐药病原体的感染，提高传染病的治愈率，增进人类健康水平。这也是本研究要解决的最根本问题。主要研究内容：本研究项目包括重要传染病的5种主要病原体：细菌、结核分枝杆菌、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒及白色念珠菌。各病原体的研究内容包括耐药性的分子流行病学、耐药性的形成及传播机制（包括新耐药基因的研究）、耐药菌的快速诊断、耐药菌感染的预防与治疗新途径等方面。1．细菌耐药机制及耐药性防治（1）多重耐药铜绿假单胞菌的耐药机制通过对碳青霉烯酶、膜通透性改变及主动外排机制3方面的较全面的研究，明确多重耐药铜绿假单胞菌的耐药机制。国内近年研究发现在铜绿假单胞菌中存在一种能水解亚胺培南但活性又能被氯唑西林抑制的酶（类似于AmpC酶但水解底物轮廓扩大包括了碳青霉烯类抗生素），因此极可能存在新的碳青霉烯酶及其它耐药机制同时参与，计划对具新特性的β内酰胺酶进行进一步的研究，预期会有新的发现。（2）大肠埃希菌耐药机制研究1）大肠埃希菌对喹诺酮类的质粒介导耐药机制研究：计划对大肠埃希菌对喹诺酮类的质粒介导耐药机制进行深入研究，研究内容包括：①质粒介导耐药基因qnrA及qnrB分子流行情况，明确质粒介导耐药机制在喹诺酮类耐药性形成中的作用。②耐药机制研究：qnr产物Qnr蛋白对喹诺酮作用靶位的保护作用、Qnr作用位点和Qnr蛋白的模建及晶体结构的研究，明确耐药的形成机制。2）大肠埃希菌等革兰阴性杆菌CTX－M型ESBLs的传播机制及传播规律：计划在原有基础上作进一步深入的研究，研究CTX－M编码基因的起源及其传播规律，从而有利于耐药菌的控制。（3）建立耐药菌快速基因诊断方法采用分子生物信息学技术，研究病原菌的基因组序列或特征性基因序列和耐药基因序列，目标是建立多重DNA引物的反应模式，在鉴别革兰阳性和革兰阴性菌的主要菌种的同时，测定耐药谱。采用分子生物学方法直接从人体体液或相关标本中检测细菌的特异性DNA，从而建立快速、准确的病原菌诊断方法。（4）建立常用抗菌药治疗各种重要病原菌的“防突变浓度”范围通过建立体外模型测定常用各类抗菌药对重要病原菌的防突变浓度（mutant-preventionconcetration，MPC）和“突变选择窗”，即建立不同抗菌药对不同细菌的防突变浓度范围及“突变选择窗”，据此制订或调整抗菌治疗方案，达到提高治愈率，减少耐药菌产生的目的。2.耐药结核分枝杆菌的分子流行病学及耐药机制（1）建立先进的分子流行病学方法着重于阐明一线抗结核药物和主要二线抗结核药物的耐药株基因突变频率及中国流行耐药株突变特点、国内主要结核杆菌耐药株的优势菌群，耐药结核菌群的流行区域、流行趋势及范围，分析耐药菌群的种类、分布、分子流行病学特征。同时，以某一研究地区（如上海）为研究场地建立示范性分子流行病学预警以及快速鉴定耐药传播（内源性或外源性）模式的平台，选用有价值的分子流行病学标记，如IS6110为基础的DNA指印技术、间区寡核苷酸分型（spoligtyping）、分枝杆菌散在重复序列（mycobacterialinterspersedrepetitiveunit，MIRU）,富含GC的多态性（polymorphicGC-richsequence，PGRS）等项技术为基础进行聚类分析，分析比较耐药簇菌株和非耐药簇菌株的差异，确定近期外源性感染的作用，揭示耐药结核病的传播规律如易发病的高危人群、传播场所以及其它影响传播的危险因子。（2）描绘完整的我国结核病耐药基因谱，发现新的耐药机制在结核分子流行病学研究基础上绘制能对我国临床诊断与防治提供指导意义的耐药基因谱，对相应的耐药机制作出研究。对于未发现当前报道的耐药基因的菌株，拟以基因芯片与蛋白质组学方法寻找差异基因与差异蛋白，定位新的耐药基因或发现新的耐药机制。（3）建立符合我国耐药现状与国情的快速分子药敏检测系统结核耐药性的快速鉴定对结核病的早期诊断、鉴别诊断、个体化的有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。我们将建立基于我国结核病耐药基因谱以及耐药机制研究基础上的快速分子药敏检测系统，并研究基因型耐药与表型耐药的相关性，用前瞻性方法指导临床用药，评估基因型耐药快速检测的临床价值。3.HIV耐药性分子流行病调查和耐药机制研究（1）HIV耐药性的分子流行病学研究利用已有的全国HIV耐药性调查网络开展未接受HIV抗病毒治疗和治疗后人群和治疗地区的耐药性流行病学调查，耐药毒株出现的情况以及影响因素分析在我国艾滋病高发区开展HIV耐药性的分子流行病学研究，对接受国家免费抗病毒治疗人群通过套式PCR扩增HIV蛋白酶和逆转录酶基因并进行序列测定，将测得序列进行分析与国际HIV耐药数据库进行比对和分析,得出治疗人群HIV的耐药突变基本资料，包括其类型、人群分布和发生发展规律。确定HIV的基因亚型，并研究不同病毒亚型与耐药性的关系。（2）HIV耐药机制研究从测定到的含各类耐药突变HIV毒株的病人分离病毒，经体外药敏试验确定HIV耐药突变株基因型与表型间的关系。同时对HIV野毒株加以不同浓度的相关药物压力筛选出相应的耐药株，研究HIV与药物的相互作用，以探讨HIV耐药株的出现与药物浓度，用药剂量与病毒复制抑制间的关系。了解耐药毒株的基因变异特点，确定我国HIV流行株的耐药株类型，基因型及表型的特点。研究耐药病毒株的适应性，结合其在体内存在情况，探讨其在人群中传播的潜在危险性。（3）HIV逆转录酶结构和功能的研究运用分子生物学和X-射线结晶学方法开展与艾滋病药物相关的HIV逆转录酶结构和功能的研究，在分子水平研究耐药性形成机制，研究包括病毒的和与之复制和变异相关的细胞组分和分子间的相互作用及其影响因素。（4）建立综合性HIV耐药数据库结合耐药分子流行病调查、体外耐药实验测试和HIV酶的结构生物学和其与细胞组分和分子的相互作用的研究结果，建立综合性HIV耐药数据库，采用多因素分析方法，确定我国不同HIV耐药基因型和表型间的关联特点，预测我国抗HIV治疗中的耐药出现频率和强度，提出我国抗HIV治疗中减少HIV耐药毒株出现的药物配伍、剂量调整和方案改进的科学建议，提出针对耐药HIV毒株的新的抗HIV药物的新设计方案和新技术路线。4.乙型肝炎病毒的耐药机制（1）核苷类似物对HBV的耐药规律及其天然无应答性的原因拟对国内/国际临床验证和临床抗病毒治疗的病人系列标本，采用PCR扩增产物直接测序和/或克隆后测序的方法，以及高灵敏度单一基因分子点突变检测技术（detectionofbasesubstitutiononasinglemolecule，DBSSM），对比治疗前和发生临床耐药时DNA序列结果，寻找与临床耐药有关的变异位点及其规律。对已确定的单一耐药位点变异，课题组已建立聚合酶链反应限制性片段多态性分析法（PCR-RFLP）、实时荧光PCR法检测，分析其发生、发展、与临床耐药病情的关系。（2）HBV变异序列特异性细胞免疫反应的研究目前国内外对变异耐药发生后为何出现不同临床结局缺乏系统的研究，为何同为出现YMDD突变的患者,一些肝病变加重甚至肝功失代偿死亡，而另一些肝功能可完全正常？核苷类似物治疗发生YMDD突变且病情加重者是由于机体免疫应答的不同还是有更重要的HBV突变？初步研究显示HBV耐药突变后“表位漂移”及“免疫显性消长”可能是影响HBV耐药不同应答转归的重要机制。本课题计划对此进行深入的研究。（3）对导致干扰素抗病毒治疗失败的宿主因素进行分析干扰素用于慢乙肝抗病毒治疗也已近二十年时间，为什么在相同基因型、重要位点变异情况相似的情况下，临床抗病毒疗效差异悬殊，抵抗干扰素治疗的机制也待阐明，我们以往和国外的一些研究工作曾就HBV基因型以及其他位点的基因变异对干扰素抗病毒疗效的影响进行分析，虽发现一些可能相关的原因，但结果尚不能令人满意。本课题将从宿主遗传因素的角度进一步探讨导致HBV抵抗干扰素治疗的机制。（4）建立并优化乙肝病毒表型耐药及药敏实验的体外鉴定系统国外已经开始利用体外药敏系统来协助临床医生选择抗病毒药物。如体外实验发现阿德福韦对YMDD变异株有明显的抑制作用，临床试验结果也证实了这一结果，而对阿德福韦产生耐药的乙肝病毒N236T变异在体外试验中仍对拉米夫定敏感，IC50的改变≤3.5倍。目前国内在基因耐药检测技术方面发展较快，已建立基因芯片、Real-TimePCR、RFLP等方法，但在病毒药敏检测系统方面还未见报道，主要原因是该系统涉及技术较复杂。我们计划建立并优化乙肝病毒表型耐药及药敏实验的体外鉴定系统，以用于研究重要的HBV耐药突变株的生物学功能，如在中国发现的rtG172E，rtG174C和rtG172E/rtG174C三种新变异株，包括体外复制能力、交叉耐药性等。同时，体外药物敏感性检测系统可以为临床医生合理处理耐药病毒感染提供强有力的依据。5．白色念珠菌耐药机制研究（1）白色念珠菌耐药性的分子流行病学研究建立真菌库，测定各菌株对各类抗真菌药物的敏感性，并重点研究氟康唑作用靶酶基因CYP51和多药耐药蛋白基因CDR1、MDR1，转录调控因子TAC1、CAP1基因的表达差异；从中选择不同来源的白色念珠菌耐药株及其亲本菌，通过基因测序，分析CYP51和TAC1、CAP1基因的序列变异特点，发现耐药优势变异；比较我国与国外耐药变异的差异，总结我国白色念珠菌耐药变异的特点及分布规律，并分析我国特有的耐药变异类型及形成原因。（2）白