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核酸大实验实验1动物肝细胞内DNA和RNA的提取和分离实验目的初步掌握从组织中分离和提纯DNA与RNA的原理和方法。实验原理细胞中核酸以DNP，RNP形式存在，而DNP,RNP在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同。DNP在0.14mol/LNaCl中溶解度最低，而RNP却易溶解，故用0.14mol/LNaCl洗涤组织匀浆，可得到DNP，再用SDS、氯仿-异戊醇除蛋白，乙醇沉淀后即可得到DNA。RNA的分离提纯目前多用酚仿抽提法。组织匀浆在苯酚与氯仿存在下，RNA与变性蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀而达到分离。分离核酸提纯核酸（SDS，苯酚，氯仿）乙醇沉淀测定仪器与试剂仪器:研钵、离心机、天平、玻璃棒、恒温水浴锅、25ml容量瓶、50ml容量瓶及实验常用器皿（约11个离心管）试剂:0.14mol/L氯化钠-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液(含1mmol/LEDTA)、10%氯化钠溶液、氯仿-异戊醇溶液（24:1）、20%十二烷基硫酸钠（SDS）、95%乙醇（预冷）、苯酚-氯仿-异戊醇醇溶液（25:24:1)、0.1mol/L氢氧化钠溶液实验操作(一)DNP与RNP的分离1、取新鲜肝脏，用表面皿称取0.5g，用0.14mol/L氯化钠-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液（含1mmol/LEDTA）冲洗除去血水。洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中，边滴加缓冲液边研磨(加入2ml），至匀浆状，转移至离心管中，每次用0.5ml缓冲液冲洗研钵至离心管，3次。（研磨时间不要超过30min）2、匀浆液于3000r/min离心15min，上清液中即含RNP，沉淀中含DNP。3、将上清液倒入另一支离心管。再往上述沉淀中加入3.5ml缓冲溶液，同样离心15min，取上清液倒入另一离心管。向DNP沉淀加入3ml10%氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内，使DNP充分溶解，留至下午用。（二）RNA的提取1、各向两支RNA上清液离心管加入与清液等体积的酚仿醇溶液（25：24：1），剧烈震荡10min，平衡后3000r/min离心15min。重复操作，直到离心后两相之间无明显变性蛋白为止。（一般重复一次即可）2、再取两支离心管各加入约上层水相2.5倍体积的预冷95%乙醇，将两支管的水相对应滴入，摇匀，置于冰箱内静置20min，3000r/min15min离心，后用蒸馏水多次润洗沉淀至烧杯，并定容至50ml.（三）DNA的提取1、下午，从冰箱取出DNP样液，加入约2ml氯仿-异戊醇溶液（24:1）和0.5ml20%SDS，上下振荡10min（注意不要过于剧烈），于3000r/min离心15min，吸取上面含DNA和DNP的水层至另一离心管，弃去中间蛋白层和下层液体。3、再次向取出的上层水相加入约1/2体积氯仿-异戊醇溶液，振荡，离心，继续抽提，直到离心后两相之间无明显变性蛋白为止。（一般重复一次即可）4、取两支离心管各加入约与离心后上层水相等体积的预冷95%乙醇，将水相分两等份滴入，边滴边搅拌，后于冰箱内静置20min，挑出絮状DNA至烧杯，再将溶液3000r/min15min离心，倒去乙醇，用氢氧化钠多次润洗沉淀至上述烧杯，溶解完全后定容至25ml.实验2地衣酚法测定RNA含量实验目的掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。实验原理核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与地衣酚（即3，5—二羟基甲苯，或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~250ug/ml范围内，光密度与RNA浓度成正比。地衣酚反应特异性差，凡是戊糖均有此反应。样品中少量DNA存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖在含量高时会干扰测定。仪器和试剂1、仪器：可见分光光度计、移液管、恒温水浴锅2、试剂：（1）100ug/mL标准RNA溶液：称取10mg纯RNA用少量水溶解(若不溶可用0.1mol／LNaOH溶液溶解，后加等量0.1mol／LHCL溶液调至pH7.0)，定容至100mL。（2）地衣酚试剂：取0.1gFeCl3·6H2O溶于100mL浓HCl配制成0.1%三氯化铁浓盐酸溶液。使用前再用上述溶液为溶剂加入0.1g地衣酚配成0.1%的地衣酚溶液。（临用时配制）（3）样品待测液：用上述实验方法提取的RNA样品试管012345100µg/mL标准RNA溶液/mL00.40.81.21.62.0蒸馏水/mL2.01.61.20.80.40地衣酚溶液/mL2.02.02.02.02.02.0摇匀，置沸水浴中煮25min(严格控制时间），冷却后（水浴冷却5分钟后直接测量），，在670nm波长处测各管光密度值光密度值00.0550.1280.1760.2320.289实验操作1、RNA标准曲线的制作(空白调零）此步省略取6支试管，按下表操作。以RNA浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。2、RNA样品的测定取两份2.0ml样品液于试管中，再各加入2.0ml地衣酚试剂，沸水浴保温25min(严格控制时间），水浴冷却5分钟（不要骤冷），然后在670nm波长处测定光密度值。每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三次取平均值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的RNA的mg数，按下式计算待测样品的RNA的含量。标曲比例系数：16.5匀浆RNA含量=比例系数*待测液吸光度/肝质量（mg/g）实验3二苯胺法测量DNA含量实验目的学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。实验原理DNA分子中的2—脱氧核糖在酸性条件中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热反应生成蓝色物质，在595nm处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光密度与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。仪器与试剂1、仪器：可见分光光度计、恒温水浴锅、移液管2、试剂：（1）200µg/mLDNA标准溶液：准确称取纯DNA10mg，以0.1mol/LNaOH溶液溶解，转移至50ml容量瓶中，用0.1mol／LNaOH溶液稀释至刻度。（2）二苯胺试剂：称取2g结晶二苯胺，溶于200mL分析纯冰醋酸中，加5.5ml浓硫酸棕色瓶保存。临用前加入2mL1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。（3）样品待测液：用上述实验方法提取的DNA样品试管012345200µg/mL标准DNA溶液/mL00.40.81.21.62.0蒸馏水/mL2.01.61.20.80.40二苯胺试剂/mL444444100℃恒温水浴中保温15min，(严格控制时间）冷却（水浴冷却5分钟后直接测量），在595nm波长处比色光密度值00.0810.1600.2310.3090.376实验操作1、DNA标准曲线的制作(空白调零）此步省略取6支试管，按下表操作。以DNA浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。2、DNA样品的测定取两份待测样品各2mL，各加入二苯胺溶液4mL，摇匀，100℃恒温水浴中保温15min(严格控制时间），水浴冷却5分钟（不要骤冷），然后在595nm波长处测定光密度值。每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三次取平均值。根据测得的光密度值，从标准曲线上得到相应的DNA的mg数，按下式计算待测样品的DNA的含量。标曲比例系数：13.26匀浆DNA含量=比例系数*待测液吸光度/肝质量（mg/g）注意事项1、戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰；某些己糖也对本法有干扰（糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍生物，在浓无机酸作用下，与苯酚生成缩合物）；去除方法为，低浓度乙醇沉淀法和醋酸钾沉淀法，提高缓冲液中NaCl浓度也可。2、样品中蛋白质含量高时,应先用5%三氯乙酸溶液(TCA)沉淀蛋白质后再测定。3、微量DNA无影响,较多DNA存在时,有干扰作用,如在试剂中加入适量CuCl2·2H2O可减少DNA的干扰,甚至某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应,产生显色复合物.此外,利用RNA和DNA显色复合物的最大吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区分,反应2min后,DNA在600nm显示最大吸收,而RNA在反应15min后,在670nm下呈现最大吸收.4、地衣酚-三氯化铁试剂需临用时配制，由于试剂中有浓盐酸，反应时需加盖保鲜膜，防止盐酸挥发。溶液配制：柠檬酸钠缓冲溶液：氯化钠8.19g，柠檬酸钠14.7g，EDTA0.3g（或0.38g含结晶水EDTA），加蒸馏水定容至1L[氯化钠用于调节盐浓度沉淀DNP，分离DNP、RNP，柠檬酸钠抗凝血，维持PH，EDTA抑制核酸酶活]20%SDS:20gSDS加蒸馏水定容至100ml[SDS为去污剂，蛋白质变性剂,结合蛋白沉淀]10%NaCl：10gNaCl加蒸馏水定容至100ml[此浓度氯化钠用于溶解DNP]氯仿-异戊醇：氯仿96ml，异戊醇4ml混合，棕色瓶保存[氯仿用于变性分离蛋白，异戊醇可消除泡沫，助于分层]酚仿醇溶液：苯酚100ml，氯仿96ml，异戊醇4ml混合（[变性分离蛋白，异戊醇可消除泡沫，助于分层]0.1mol/LNaOH溶液：4gNaOH加蒸馏水定容至1L[定容DNA的溶剂]二苯胺试剂：A液使用前称取2g结晶二苯胺，溶于200mL分析纯冰醋酸中，加5.5ml浓硫酸棕色瓶保存。B液2mL1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）临用前加入，可提前配制50ml存于冰箱地衣酚试剂：取0.1gFeCl3·6H2O溶于100mL浓HCl配制成0.1%三氯化铁浓盐酸溶液，为地衣酚贮存液。使用前再用上述溶液为溶剂加入0.1g地衣酚配成0.1%的地衣酚溶液。（临用时配制）溶液配制：