4.高效液相色谱法

常州市高技能人才培训与鉴定高效液相色谱法常州工程职业技术学院制药系吴朝华2011年7月14日常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定主要内容基本原理仪器日常维护与简单故障排除常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成，这种新的色谱法称为高效液相色谱法。它可用来做液固吸附、液液分配、离子交换、空间排阻色谱分析。高效液相色谱法常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定高压：液体作为流动相流经色谱柱时，受到的阻力较大，施加高压能使液体迅速通过，一般高达150-350×105Pa。高速：载液在色谱柱内的流速较之经典液相色谱法高得多，一般可达1-10mL/min。高效：高效液相色谱法的柱效能可达3万塔板/米，而气相色谱法的柱效能仅为2000塔板/米。高灵敏度：采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度，荧光检测器可达10-11g。高效液相色谱法特点常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定高效液相色谱与气相色谱的比较样品的热不稳定性样品分子量HPLC•室温或低于室温均可作分析测试气相色谱•样品必须在高温进样口及色谱柱均不会受到任何破坏HPLC气相色谱•理论上讲，没有上限•实际上有溶解性的限制•通常情况下小于500amu常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定高效液相色谱与气相色谱的比较样品制备进样量HPLC•固定相和流动相均参与气相色谱•溶剂必须具有挥发性，且其通常比被分析物沸点低HPLC气相色谱•进样量取决于色谱柱内径•通常情况下为1-5L常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定高效液相色谱与气相色谱的比较分离机理检测器HPLC•固定相和流动相均参与气相色谱•流动相仅作为样品载体HPLC气相色谱•最常见的是紫外-可见光度计•很广范围的非破坏性检测器•三维检测器•灵敏度可达pg•对有机化合物最常见的是FID常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定液相色谱分离原理液相色谱是如何完成混合物的分离？混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离。石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定高效液相色谱仪液相色谱仪最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。液相色谱仪的工作过程：输液泵2将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器3将样品导入,流动相将样品带入色谱柱4,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器5，检测到的信号送至数据系统6记录、处理或保存。常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定高效液相色谱法的分类通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。但在实际应用中由于方法与应用对象的独特，往往采用如下一些比较固定的名称。类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定高压输液泵基本要求流量准确可调。可控制流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度小于±0.5%。耐高压。要求泵的输出压力在30-60MPa。流动相液流稳定。输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。泵的结构材料应耐化学腐蚀。常见高压输液泵输液泵一般分为恒流泵与恒压泵，恒流泵应用更广泛。气动放大泵（恒压）双柱塞往复泵（恒流）常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定脱气脱气原因流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。方法超声波振荡脱气惰性气体鼓泡吹扫脱气真空脱气装置常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定梯度洗脱1高压梯度：一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定梯度洗脱2低压梯度：只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定吸附色谱1（adsorptionchromatography）原理基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。固定相固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。活性硅胶：一种多孔性物质,因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-结合而具有三维结构,表面具有硅羟基,作吸附剂的硅胶需经加热处理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔径分布分为表面多孔和全多孔两类。硅胶既是吸附色谱最常用的固定相，也是分配色谱、离子色谱等色谱固定相的常用基质。常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定吸附色谱2（adsorptionchromatography）流动相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等等。分离过程：硅羟基呈微酸性，易与氢结合，是吸附的活性点。流动相溶剂在吸附剂表面形成单分子或双分子吸附层，当样品分子进入色谱柱，样品主要靠氢键结合力吸附到硅羟基上，与流动相分子竞争吸附点。样品分子反复地被吸附，又反复地被流动相分子顶替解吸，随着流动相的流动而在柱中向前移动。因为不同的样品分子在固定相表面的吸附能力不同，因而吸附-解吸的速度不同，各组分被洗脱的时间（保留时间）也就不同，使得各组分相互分离。应用：早期的HPLC中应用较多，目前主要用于结构异构体分离和族分离。如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定分配色谱1（partitionchromatography）原理主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。键合固定相分配色谱原本是基于样品分子在包覆于惰性载体（基质）上的固定相液体和流动相液体之间的分配平衡的色谱方法，因此也称液-液分配色谱。因为作固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。这种化学键合型固定相是当今HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三。极性键合固定相键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定非极性键合固定相键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（OctaDecyltrichloroSilane）柱或C18柱，它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反应与硅胶表面的硅羟基结合，在硅胶表面形成化学键合态的十八烷基，其极性很小。正相HPLC（normalphaseHPLC）：是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。反相HPLC（reversedphaseHPLC）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。分配色谱2（partitionchromatography）常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定检测器：连续监测柱后流出物组成与含量变化的装置。检测器（Detector）检测器检测下限选择性梯度主要特点紫外-可见光10-10g/mL(下同)有可对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。荧光10-12～10-11有可选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响。电导10-8有不可是离子性物质的通用检测器；受温度和流速影响；不能用于有机溶剂体系。电化学10-10有困难选择性高；易受流动相pH值和杂质的影响；稳定性较差。蒸发光散射10-9无可可检测所有物质。示差折光10-7无不可可检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感质谱10-10无可主要用于定性和半定量。原子吸收10-13～10-10有可选择性高。ICP-AES10-10～10-8有可可进行多元素同时检测。常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系2011-7-14常州市高技能人才培训与鉴定紫外-可见光（UV-VIS）检测器原理基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。多数有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。一般的液相色谱仪都配置有UV-VIS检测器。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。常州工程职业技术学院制