结核病诊断与鉴别诊断

结核病诊断与鉴别诊断山东省胸科医院邱丽华2014-06-04诊断技术•细菌学•分子生物学•免疫学•生化•影像•病理•经皮肺穿刺•气管镜•胸腔镜细菌学检查•涂片和培养•快速培养、药敏检测技术•噬菌体裂解试验•结核杆菌L型检查涂片和培养•涂片的优点：①简便：技术要求低，不需特殊仪器设备；②快速：当天可得出结果；③价廉：所耗材料价格低廉。•涂片的缺点：①敏感性低，通常需5000—10000条菌／ml才能够得到阳性结果；②特异性差，各种分支杆菌均可着色，需要进一步鉴定是否为结核分支杆菌；③无法区别死菌与活菌。•痰涂片抗酸染色阳性检出率受检验人员的技术水平和收集痰液标本的质量影响很大，特别是咳痰的时间，痰标本的性状等因素。•痰涂片荧光显微镜检查比光学显微镜检具有更高的灵敏度，且所需时间少，值得开展。•培养的灵敏度略高于涂片法，并是鉴定活菌的可靠方法，还可进一步进行菌种鉴定和药敏试验，被誉为诊断结核病的“黄金标准”。•常规罗氏培养基培养时间长，需4—8周才能出结果，而且阳性率也只有30-40%；同时各种分支杆菌均可生长，需结合菌种鉴定才可确定是否为结核分支杆菌。•由于涂片和培养的阳性检出率偏低，致使大量结核病人漏诊或误诊，严重影响了临床诊治的需要。快速培养、药敏检测技术•BactecTB460•BactecMGIT960BactecTB460•基本原理是分枝杆菌在含有14C标记棕榈酸的12B培养基中生长、分解利用棕榈酸，产生14C02，仪器检测系统自动测试14C02含量，并将其换算成生长指数(GI值)，GI值升高提示有分枝杆菌生长。•在12B培养基中加入一定浓度的抗痨药物，则可进行分枝杆菌的药敏试验。•应用结果表明BactecTB460可缩短培养时间（涂阳病例平均阳性天数9—14天），药敏试验只需5－7天，同时阳性检出率约提高10％，且操作简便、自动化强，还可进行快速菌型鉴定。•存在的主要问题是液体培养基中无法观察菌落形态，且污染率高于罗氏培养，并且仪器与试剂价格较贵、有放射性污染BactecMGIT960•基本原理是其所使用的培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分支杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活，而发出荧光。检测系统每隔60分钟连续测定培养管内荧光强度，从而判断管内分枝杆菌生长情况。该培养仪可用于痰、支气管灌洗液、胸水、腹水、脑脊液、尿液、脓液、关节液、病灶组织或干酪块各种临床标本的分枝杆菌培养、初步菌种鉴定和药物敏感试验MGIT960•自动化程度更高、操作更为简便，缺点是价格更高。噬菌体裂解试验•分支杆菌噬菌体是一种DNA病毒，因其对分支杆菌有特异性而得名•噬菌体D29对缓慢生长的结核分支杆菌及快生长的耻垢分支杆菌有亲噬性，因此已被用于结核分支杆菌的快速检测及药敏试验原理•噬菌体感染结核分支杆菌并在菌体内繁殖，加入杀毒剂将未进入菌体的噬菌体杀灭，已进入活菌体的噬菌体不受影响•噬菌体在分支杆菌体内复制，并将菌体裂解。释放出来的噬菌体可感染随后加入的耻垢杆菌，并将其裂解•裂解后的菌体在培养平板上表现为噬菌斑•根据噬菌斑的有无判断检测结果•有噬菌斑表明标本中含有结核分支杆菌，反之为阴性•由于耻垢杆菌生长快速，18-24小时即可出现•菌落，因此该法1-2天即可观察结果，非常有利于结核分支杆菌的快速诊断。由于噬菌斑的数量与待检标本中结核杆菌的含量成正比，因此可根据噬菌斑的数量推算出待检标本中结核杆菌的含量。此外，该法在实验过程中将结核杆菌裂解，故使操作人员更加安全结核杆菌L型检查•结核杆菌受理化因素、药物及机体免疫力的影响，其细胞壁可发生变异，表现为部分或全部缺损，称为L型•由于细胞壁缺陷，导致结核杆菌的形态、染色异常，用传统细菌学技术难以检测出，造成假阴性•菌阴肺结核患急者痰标本L型检出率为18.2％；复治、难治性肺结核患者中，L型阳性率为29.6％；结核性脑脊液L型阳性率为17.0％L型的检查方法主要是涂片和培养•涂片技术简便、快速，可用于各种临床标本的结核杆菌L型检查，但其形态不易与其他细菌的L型相区别，易造成误诊或漏诊•培养是检查结核杆菌L型的有效方法，但其在常规罗氏培养基上难以生长，需特殊培养条件分子生物学诊断聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)•DNA序列测定聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)•特点：敏感性高、特异性强、快速等特点•对于结核分支杆菌这类生长缓慢的病原菌的研究与诊断具有重要意义•假阳性：操作污染、引物特异性不高和电泳结果判断有误•假阴性：标本前处理及DNA抽提方法不当和标本中存在着抑制物及试剂质量•致命弱点是不能区分死菌与活菌•RNA只存在于活菌内，mRNA的量可反应细菌的生活状态。mRNA含量高，说明正在表达的基因多，活动旺盛。但mRNA半衰期很短，只有3—6分钟，所以直接用mRNA作检测指标不现实•逆转录PCR：将细菌mRNA分离后用逆转录酶转换成cDNA(complementDNA)，再用cDNA为模板进行PCR扩增。当菌体内mRNA含量高时，逆转录生成的cDNA量也相应地增多DNA序列测定•DNA序列测定不仅能够用于突变的检测，而且能够确定突变的部位与性质，是检测基因突变的最理想方法，也是判断突变的金标准DNA序列测定•在结核分支杆菌耐药基因研究中得到广泛应用，用于rpoB、inhA、katG、rpsL和gyrA基因突变检测•Frank等对INH耐药株进行DNA序列测定分析，发现在KatG基因中，尤以第463位点上精氨酸→亮氨酸的突变及第315位点上丝氨酸→苏氨酸的突变最为常见。Telenti等的研究发现所有rpoB基因突变都集中在一个23个氨基酸的区域内。突变频率最高的是在氨基酸密码子531位（丝氨酸→亮氨酸）上，次之为526位（组氨酸→酪氨酸）•对212株MTB包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定，结果有89．0％(145／163)的耐药株存在rpoB基因突变，而对照敏感株均无突变。免疫学检测在结核病诊断中的应用现况•结核菌素试验（ＴＳＴ）：ＰＰＤ.•酶联免疫斑点试验(T-SPOT.TB)•结核抗体测定•结核抗原测定•循环免疫复合物测定结核分枝杆菌抗原性的研究•旧结核菌素（OT）:•纯化蛋白衍生物（PPD）•24kDa抗原MPT64•ESAT-6•CFP10•38kDa蛋白•脂阿拉伯甘露糖（LAM）体内免疫细胞功能测定：皮肤试验TST•ＯＴ：结核菌液体培养基中提取的含结核菌体蛋白及代谢产物•ＰＰＤ：1932年在旧结素的基础上发现，由结核菌菌体制取的纯蛋白衍生物，提高了此反应的敏感性，减少了非特异性反应PPD•虽称为纯化蛋白衍生物，实际上是一种相当复杂的混合物，包含有多种抗原成分•与单一抗原不同，多克隆抗原可补充大量抗原特异性T细胞到抗原注射部位以产生特有尺寸的皮肤反应TSTPPD•结核菌素纯蛋白衍化物（TB—PPD）试验，是诊断结核感染的常用参考指标，与旧结核菌素相比，TB—PPD具有纯度高、灵敏度高、全身反应较少等优点•方法：用1ml容量的兰芯注射器，4－5号针头，前臂掌侧中下1/3处为最佳（此处皮肤薄嫩，反应敏感易观察）。避开疤痕，血管和皱褶。用75%酒精消毒局部皮肤，以皮内注射法将PPD0.1ml(含5个结素单位)缓慢注入，局部可出现7－8mm大小的圆形橘皮样皮丘(有毛孔出现)，不要在注射部位按压揉搓和肥皂刺激，读取结果前尽可能避免用激素类的药物迟发型超敏反应体内免疫细胞功能测定：皮肤试验结果与意义•注射后48与72小时观察结果，用卡尺测量硬结纵横直径，硬结平均直径=(纵径+横径)/2•判断标准：硬结平均直径如小于5mm为阴性，大于等于5mm小于20mm为阳性反应[5～9mm为弱阳性(+)，10～19mm为阳性(++)]，20mm以上(+++)或局部有水疱、坏死、淋巴管炎均为强阳性。与旧结核菌素一样，TB—PPD试验除引起局部反应外，偶可引起全身反应，但较前者少见。TB—PPD试验的临床意义•婴幼儿：常用于卡介苗接种的选择和监测。阳性时常表示已感染结核菌而不需要接种卡介苗；阴性则应该及时接种卡介苗。如果皮试呈强阳性时常表示感染过结核菌体内有活动性结核灶，应及时进行结核菌检查、影像学检查、血沉等检查，如无任何症状，上述各项检查未发现异常，进行预防性抗结核治疗，如果上述检查有异常应考虑结核病，进行正规抗结核治疗TB—PPD试验的临床意义•成年人：如果PPD5单位试验阳性，仅表示有结核感染，并不一定患病；呈强阳性时，进行X线检查，排除活动性结核病，应进行预防性抗结核治疗，否则应根据不同情况进行正规三药以上联合抗结核治疗意义•结核病的诊断与鉴别诊断(菌阴肺结核、儿童结核、无痰患者及肺外结核、特别是结核性脑膜炎等）•器官移植术并发结核感染的监测指标假阴性（30%~2%）•1)机体方面原因：如某些临床确诊的活动性结核患者，而体液免疫测定结果则为阴性，其原因可能与个体的免疫功能异常有关。上述原因均可导致机体不产生或仅产生少量特异性结核抗体，以致于无法与正常人群的结核抗体水平相区分•2)特异性免疫复合物的形成：由于活动性结核患者体内产生的特异性抗体，可与结核抗原结合，形成免疫复合物，从而导致结核抗体测定为阴性•3)方法方面的因素所致的假阴性假阴性•在临床上有感染结核的确切依据而患者PPD试验却阴性，这种情况常见于以下疾病：初次感染结核菌4～8周以内、重度营养不良、恶性肿瘤、机体免疫缺陷性疾病（先天性免疫缺陷症、艾滋病）、免疫抑制剂使用者等，个别老年人因机体变态反应功能低下也常呈阴性反应酶联免疫斑点试验(T-SPOTTEST)•测定原理1、利用结核杆菌感染者外周血中存在结核特异的活化T淋巴细胞2、这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌γ干扰素3、外周血单核细胞，结核特异的混合抗原A和混合抗原B，对照试剂一起加入预先包被抗γ干扰素抗体的微孔培养板进行培养•测定原理4、当外周血单核细胞中存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞时，培养液中加入的结核杆菌特异混合抗原多肽A和B将刺激这些效应T淋巴细胞分泌γ干扰素。5、分泌的γ干扰素被微孔板上的抗体捕获，再次加入的碱性磷酸酶标记并针对γ干扰素不同表位的抗体与被捕获的γ干扰素结合，滞留在微孔板表面。6、显色底物溶液在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每一个斑点代表一个γ干扰素分泌细胞（结核特异的效应T细胞）。通过对斑点进行计数可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。TSPOT.TB•阴性孔PanelAPanelB阳性孔释放反应在结核分枝杆菌感染和结核病诊断中的意义ESAT6的IFN-γ释放反应在结核病诊断中•国外研究发现与排菌患者密切接触的健康人的PBMC经ESAT6抗原刺激后分泌IFN-γ的细胞数明显高于免疫功能显著抑制的结核病患者•本研究结果发现,结核病患者和与之密切接触的健康者之间,ESAT6抗原刺激后PBMC释放的IFN-γ差异均无统计学意义•ESAT6抗原的IFN-γ释放反应无法鉴别诊断结核分枝杆菌感染和结核病免疫状态•这种现象可以解释为ESAT6抗原是结核分枝杆菌重要的T淋巴细胞活化抗原,很容易被处于结核性感染和临床结核病发病的不同活化状态的T淋巴细胞所识别,并快速产生高水平的IFN-γ38000抗原的IFN-γ释放反应在结核病临床诊断中的意义•在PPD、ESAT6和38000三种抗原之间,仅38000抗原的PBMC释放IFN-γ水平在结核组和非结核组间差异有统计学意义•提示38000抗原体外IFN-γ释放反应可以作为结核病辅助诊断指标,特别可作为菌阴肺结核和肺外结核的临床辅助诊断手段•38000抗原为一磷酸盐转运膜脂蛋白,有多种特异和非特异抗原决定簇。但目前对其免疫功能了解有限,尚难对在感染和临床结核病免疫状态下的PBMC的IFN-γ释放差异做出合理解释生化•ADA腺甘脱氨酶•Lyz溶菌酶•LDH：乳酸脱氢酶【病理】结核病的基本病变主要有三种：渗出增殖变质基本病理变化渗出为