微生物实验培养基的制备和消毒灭菌

二、实验原理（一）、培养基的配制1.培养基：人工配制的供微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的营养基质。2.培养基的配制原则（1）目的明确：不同微生物所需营养基质不同，配制培养基的目的也有不同。（2）营养协调：营养成分的比例和浓度要适当。（3）理化适宜：渗透压、pH和氧化还原电位。（4）经济节约。（二）、灭菌方法及原理1.高温灭菌（有干热和湿热两种）高温使得细胞内蛋白质变性达到灭菌目的。（1）干热：160-170℃，1.5-2h，适合玻璃、金属等器具的灭菌；（2）湿热：121.3℃，15-20min或115℃，35min，用途广泛。2.紫外杀菌（1）紫外线处理，使得细胞产生TT二聚体，干扰DNA复制。电离过程中产生的O3和H2O2均有杀菌作用。（2）用于接种箱、空气及物体表面灭菌。三、实验材料1.药品和试剂葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、琼脂粉、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、KNO3、MgSO4、FeSO4、孟加拉红、1mol/LNaOH溶液。2.器材（1）培养基配制所需器材试管、烧杯、三角瓶、量筒、玻璃棒、铁架台、漏斗、天平、牛角匙、高压锅、微波炉、pH试纸（5.5-9.0）、棉花、纱布、线绳、聚丙烯袋等。3.灭菌所需材料和器材培养基、无菌水（试管+三角瓶）、培养皿、移液管、高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱、紫外线灯等。四、实验步骤---斜面培养基的制备和灭菌计算→称量→加热溶化→调pH→过滤（可省略）→分装→加塞（附棉塞制作）→包扎(皮筋或绳子)→灭菌→摆斜面→无菌检查。1.称量按照配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状药品（如牛肉膏），应用烧杯和玻璃棒称量。2.配制（1）向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。（2）如果配制固体培养基，在琼脂熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。一般要求琼脂沸腾3次，完全熔化后，补足所失水分。3.调节pH值培养基溶解后，用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1MHCl和1MNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。4.过滤用滤纸或多层纱布，无特殊要求时可省去。5.分装（1）将培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。（2）分装量①斜面：装量为管长的1/5。②液体培养基：装量为管长的1/4。③半固体培养基：装载量为管长的1/3。（3）注意分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。6.灭菌塞棉塞，包扎，灭菌。培养基做完后，要求在2-4小时内灭菌，否则会被污染。7.摆斜面灭菌完毕，冷却到60℃左右再摆斜面，以免产生过多冷凝水。五、附：培养基配方和灭菌方法（一）、培养基配方1.牛肉膏蛋白胨培养基（g/L,培养细菌用）牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-20g（取18g）半固体取10g，液体不加水1000mlpH7.0-7.2121℃灭菌20min2.高氏1号（g/L,培养放线菌用）可溶性淀粉20gKNO31gNaCl0.5gK2HPO40.5gMgSO40.5gFeSO40.01g琼脂15-20g（取18g）水1000mlpH7.2-7.4121℃灭菌20min3.马丁氏培养基（g/L,分离真菌用）葡萄糖10g蛋白胨5gKH2PO41gMgSO40.5g1/3000孟加拉红100ml(???)琼脂15-20g（取18g）pH自然水补足至1000ml115℃灭菌30min（二）、灭菌方法1.高压蒸汽灭菌（湿热）向锅里加水→放灭菌物品→加盖加热→排冷空气→升压、升温→维持所需温度20-30min→降压、降温→开盖取物→趁热摆斜面。2.鼓风干燥灭菌包好灭菌物品→放入烘箱内→设置温度→升温、恒温、降温（70℃以下）→开箱取物。3.紫外灭菌放待灭菌物品→甲醛熏蒸→开紫外线（30min）→关灯。棉塞制作六、注意事项（一）、实验顺序1.先刷试管、再配制培养基，无菌水（分别用三角瓶和试管盛放），做好标记后，进行高压蒸汽灭菌；2.将培养基和无菌水放入灭菌锅后，组长报告老师后，再学习作棉塞、包平皿和移液管（孔口无堵塞），做好标记后，待灭菌。（二）、配制培养基时注意事项1.称量要准确，取药品的角匙不能混用。2.加热融化时要不断搅拌，以免糊底和溢出,（每加热30s关掉电源，开盖看一次）。3.蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速。4.淀粉要先用少量冷水调成糊状，倒入沸水中，加热溶解，再加入其它成分，以免成干面团。5.对微量成分，先配成溶液后再加入。6.节约药品。（三）、灭菌注意事项1.高压灭菌：切勿脱水工作，排净冷空气，工作人员不能远离，当压力降到“0”时再开盖取物。2.干热灭菌：物品不要与烘箱内壁铁板接触；温度不能超过170℃；待温度降至70℃以下后，再开盖取物。3.紫外线灭菌：待灭菌物品要单摆开，不要直视紫外线光，更不能在紫外线光下工作。灭菌后通风，排出O3。