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微生物学实验技术第一章普通光学显微镜的使用一、普通光学显微镜现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。油镜：放大倍数最大，可达100x，使用时需要在载玻片和镜头之间滴加镜油。1）增加照明亮度2）增加显微镜的分辨率二、使用前准备：1）光源调节自带光源或自然光源2）目镜调节双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或双眼视力有差异的观察者。3）聚光器调节光圈、光源亮度、聚光器高度三、显微观察1）低倍镜观察：个体较大的微生物如酵母菌的观察，也用来确定高倍镜的观察视野。养成好的调焦习惯：侧面观察2）高倍镜观察：个体较小微生物的观察。适当调节光圈及视野亮度。物镜同焦3）油镜观察：主要用来观察细菌。香柏油，光圈，照明一般情况下，应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。注意：切不可将高倍镜转动经过加有镜油的区域。按照说明书对显微镜进行清洁保养。第二章细菌制片一、涂片取一块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于载玻片中央；用接种环无菌操作在营养琼脂斜面上挑取适量菌苔，将沾有菌苔的接种环置于载玻片上的蒸馏水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若用液体培养物涂片，可用接种环蘸取1－2环菌液直接涂于载玻片上。二、干燥自然干燥、用电吹风干燥。三、固定涂菌面朝上，通过火焰2-3次。四、镜检第三章细菌的革兰氏染色微生物中的细菌，其细胞小而透明，用压滴片或悬滴片在光学显微镜下观察时，菌体和背景没有明显的明暗差，不易看清其形态，更难以识别它们的结构。因此，需要对菌体进行染色，借助于染料使菌体着色后颜色的反衬作用，可以十分清楚地观察到细菌的形状、基本结构（壁、膜、细胞质、核及内含物）及附属结构（荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等）。革兰氏染色1.制片取活跃生长期菌种按常规方法涂片(不宜过厚)、干燥和固定。2.初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1min后倾去染液，水洗至流出水无色。3.媒染先用碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。4.脱色将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管加95%乙醇脱色(一般20-30s)，当流出液无色时立即用水洗去乙醇。5.复染将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。6.镜检油镜观察。革兰氏阴性菌：细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，含有较多易被乙醇溶解的类脂质，所以用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。革兰氏阳性菌：细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。第四章真菌形态观察一、酵母菌形态观察及死活细胞鉴别单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，一般通过美蓝染液水浸片法或水一碘液浸片法来观察酵母菌形态。1、美蓝染液水浸片法滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，无菌操作用接种环由酿酒酵母麦芽汁斜面培养物挑取少许菌体置于染液中，混合均匀。用镊子取一块盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态，并根据细胞颜色区分死活细胞。染色30mm后再次观察，注意死活细胞比例是否发生变化。美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色。由于新陈代谢，活细胞胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型转变成无色的还原型，染色后活细胞呈无色。死细胞或代谢能力微弱的衰老细胞胞内还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色。2、水一碘液浸片法将革兰氏染色用碘液用水稀释4倍后，滴加一滴于载玻片中央，无菌操作取少许菌体置于染液中混匀，盖上盖玻片后镜检。二、霉菌形态观察