微生物工程实验

发酵工程实验室规则1.实验室内严禁饮食吸烟。2.进入实验室需穿实验服。3.实验前将桌面清理赶紧，非必要之用品放入抽屉中，必需用的书籍和文具等也应放置在非操作区，以免污染。4.坐在实验椅上操作实验，勿随意走动或奔跑。5.实验进行之前应确实了解其目的以及进行步骤，才能独立操作并于实验结束后分析结果。6.认真进行各项实验，严格掌握无菌技术。各个实验用品按指定地点存放。7.实验中发生差错或意外事故时，应立即报告老师及时处理。切勿隐瞒或自作主张不按规定处理，如万一发生有菌材料污染桌面、衣物等，应立即用抹布浸沾2～3%来苏（或5%石炭酸液），泡在污染部位，经半小时后方可抹去。如手上沾有活菌也用上述消毒液浸泡10分钟左右，再以肥皂及自来水反复洗净。8.要爱护室内仪器设备，按使用规则操作，并应节约使用实验材料。如不慎损坏了器材等，应报告教师。9.做好实验记录，写好实验报告。10.关于实验材料：培养基、培养液接种前均应清楚标示日期、组别、菌名及姓名。11.实验结束后，使用过的仪器、设备、器皿一律物归原处，每组小组长负责清理工作。12.值日生由各组同学轮流担任，负责实验结束后的整理、清洗及打扫工作，另外离开实验室后要负责水、电、门、窗的安全。每次使用发酵罐及实验过程中换人时，必须填写好发酵罐使用记录本。实验过程当中，一台发酵罐必须要有至少一人看守。考核方式（1）实验报告：要求报告内容包括：题目、目的、原理、操作步骤、实验结果及讨论。（2）考核方式：平时成绩（实验预习、考勤、纪律、实验仪器的组装和使用能力，实验的技能技巧，实验态度以及安全、卫生和药品的节约等）占40%；实验报告占60%。实验安排一．液态发酵——酵母菌的上罐发酵1)菌种的扩培2)发酵罐的结构和灭菌3)单因素实验的设计与取样4)单因素实验比较及生长曲线的测定二．固态发酵——葡萄酒的酿制及菌种的分离实验一.固体发酵——葡萄酒的酿制及菌种的分离一．实验目的1.了解酵母菌作用下制成葡萄酒的过程。2.熟悉葡萄酒的制作方法。3.学习从发酵液中分离酵母菌。二．实验原理酵母菌在厌氧的状态下可把糖分解为酒精和二氧化碳。葡萄酒就是在酵母菌的作用下酿制而成。三．实验药品及器材葡萄；白砂糖；发酵器皿；保鲜膜等四．实验步骤1.清洗：用水整串淋洗，用洗净的手将葡萄尽量撕揉碎，连皮、籽一起装罐。。2.入罐：粉碎后的葡萄果液可装入清洁最好消毒后的干燥陶瓷、玻璃、无毒塑料容器进行前发酵。（容器要稍大，以保证装葡萄果液后有30%的空间，因为剧烈发酵时会产生气泡，会将葡萄皮往上翻涌，装得太满会溢出容器）3.加白糖量：每斤葡萄汁要加40-60克白糖（糖加少了，影响发酵和酒精度；加多了，成本高。而且糖浓度太大，会使单细胞酵母的细胞壁渗透压过大，影响生长）。加糖一般分二次加入。第一次在装入葡萄后24小时，加入一半，3-4天后视发酵情况再加剩余的一半。4.前发酵：装瓶罐后，先在25-28度环境里放置24小时，不要加糖。前发酵时容器不能密封，酵母繁殖需要氧气，发酵过程中会产生的二氧化碳需要排除，还要将上浮的果皮按入果液中进行搅拌，又要分次加糖搅拌等一系列的操作，都需要开盖才行。经过一周左右发酵，把糖消耗完毕后自然停止发酵，果皮不再浮上来，即达到止发酵点。6-7天后应把皮、籽过滤取出。5.后发酵：一般前发酵7天后，将果汁内的皮、籽用筛网或尼龙纱网布过滤取出，用滤纸再过滤一次，装入清洁容器密封进行后发酵20-30天。此时容器最好不留空隙，切断氧气，防止细菌侵入。也可在液面上加些食用酒精，酒精比重比葡萄酒小，浮在表面形成保护层隔断氧气。同时要避光，防止酒色氧化变浅，所以，容器不能用透明的瓶。后发酵时用软木塞密封装瓶6.30天后启封，可以发现酒液变澄清，底部有一层沉淀，这是酵母完成历史使命后的“尸体”及杂质。7.上层的清纯酒液同样用虹吸或过滤的方法再提纯一次。用不透光的酒瓶灌装，然后密封，存放温度最好在12度，酒瓶横躺或略微瓶口向下倾斜存放，可保存二年左右。8.酒精度的测定：对第7天，第30天的葡萄酒液测酒精度①用4层纱布过滤发酵液.②量取过滤液100ml于蒸馏瓶中，另加入50ml蒸馏水，加入数粒玻璃珠防止暴沸，装上冷凝管，加热蒸馏，直至馏出液体积约为95ml时，停止蒸馏。③用蒸馏水定容至100ml，用酒精计测量，按测得的实际温度和酒精计示值查附表2，换算成20℃时的酒精度。五．实验结果及讨论从色、香、味以及所测得的酒精度等方面对所酿制的葡萄酒进行评价从葡萄酒中分离野生型酵母菌1.取成熟前15天的紫皮中等颗粒的葡萄750克，挑出烂葡萄；2.摘除蒂，用洗净的手充分捏碎葡萄；3.装入清洁的非金属容器加盖，在20-25度环境中放置24小时；4.加入30-40克白糖，用木筷拌匀，并把葡萄皮按入果液中；5.发酵3-4天后再加入30-40克白糖拌匀，并把浮起的葡萄皮按入果液中；6.7天后发酵停止，用非金属筛网布和滤纸、细布过滤去掉葡萄皮及籽；7.静止12小时，用乳胶管虹吸出清纯酒液（或用滤纸、细布过滤）后装瓶密封；8.30天后，再过滤一次装瓶密封、避光、低温、平躺保存。9.酒精度的测定：对第7天，第30天的葡萄酒液测酒精度①用4层纱布过滤发酵液.②量取过滤液100ml于蒸馏瓶中，另加入50ml蒸馏水，加入数粒玻璃珠防止暴沸，装上冷凝管，加热蒸馏，直至馏出液体积约为95ml时，停止蒸馏。③用蒸馏水定容至100ml，用酒精计测量，按测得的实际温度和酒精计示值查附表2，换算成20℃时的酒精度。10.查阅相关资料，设计实验从葡萄酒中分离野生型酵母菌五．实验结果及讨论从色、香、味以及所测得的酒精度等方面对所酿制的葡萄酒进行评价对分离所得的野生型酵母进行描述实验二、菌种的扩培一．实验目的：1.熟练掌握无菌操作技术2.了解生物发酵过程中种子的扩培过程二．实验原理：500ml500L10L扩培过程三．实验器材1.实验仪器摇床1台；超净工作台6台；电炉6个；玻璃棒12个；50ml量筒6个；500ml量筒6个；100ml烧杯6个；500ml烧杯6个；250ml三角烧瓶12个；500ml三角烧瓶30个；接种环6个；酒精灯6个；棉线、纱布、报纸若干；天平6个2.药品蛋白胨、葡萄糖NH4Cl、蒸馏水3.菌种酵母菌斜面6支•种子培养基及发酵培养基•蛋白胨10g葡萄糖40g，蒸馏水1000ml，pH自然，115℃，20min四．实验步骤1.斜面的活化：①PDA培养基100ml，分装试管，灭菌后摆成斜面。②接酵母于斜面中，28℃，48h2.种子的培养①种子培养液的配置500ml，取部分种子液于2个250ml锥形瓶，每个锥形瓶装50ml（作一级种子瓶），余下种子液分装于四个500ml锥形瓶中，每个锥形瓶装100ml（作二级种子瓶），115℃，20min灭菌。②用接种环挑取斜面2环转接于一级种子液中，150rpm，28℃，48h。③取一级种子液，无菌操作将种子液混合均匀以后，用移液枪以10%的接种量接种于二级种子液中，150rpm，28℃，48h。3.准备一瓶无菌蒸馏水500ml，灭菌，待用。四．实验步骤–通过按照给定的研究题目，独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。–各组独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程实验三、发酵罐的结构与灭菌实验四、单因素实验的设计与取样一．实验目的：1.掌握小型发酵罐管路消毒、空消、实消、菌种培养等技术。2.学习掌握小型发酵罐接种、取样操作系统。二．实验原理：•发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动的调控实验所需的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等学科研究所必需的设备。–小型发酵罐：它主要有6部分组成。•罐体、搅拌系统、传热装置、通气系统、消泡系统和各种参数检测器．–离位发酵罐和在位发酵罐三．实验器材1.高压蒸汽灭菌锅3台；在位机械搅拌式发酵罐3台；离位机械搅拌式发酵罐3台2.菌种：E.coli3.种子液；无菌蒸馏水；泡敌4.铁架台6个；试管架6个；三角烧瓶；小试管；酒精棉球若干；工业用酒精一瓶5.棉线手套6双；接种用的大试管60支；四．实验步骤1.在位发酵罐灭菌1)空气过滤器及管路的消毒：蒸汽经空气过滤器及以后的空气管道进入发酵罐内。压力保持在0.10～0.11MPa之间。（注：压力不得超过0.12MPa，否则过滤器芯会损坏）。消毒时间为30min。到时间后，关闭蒸汽阀。将空气经流量计进入空气过滤器（0.4VVM），吹干20min。2)空消：排尽蒸汽管中的冷凝水，使蒸汽从罐底缓慢进入发酵罐（微开）。打开上部蒸汽阀，使蒸汽通过进气管进入发酵罐；对发酵罐进行空消。在灭菌过程中，应时刻注意罐压，并控制在0.11～0.12MPa之内，空消时间为30～50min。当温度降至80℃以下时，才能排尽发酵罐内的冷凝水，随即关闭冷凝水阀。调节进气管和排气口，使罐压保持在0.03～0.05MPa之间。3)加培养基液：打开发酵罐的排气阀，调小进气阀得开度，卸去罐内压力；按要求各组配制不同的发酵培养基2.5L，加入培养基。加消泡剂1.5ml（0.03~0.035%）。拧紧加料口螺母。4)实消（必须将安全防护罩装上）排尽加热管的冷凝水，通入蒸汽，加热培养基，同时开通电源，开启搅拌电机，调节电机转速至150rpm左右，进行慢速搅拌。当发酵罐内温度达到85℃后，打开蒸汽阀门，将蒸汽徐徐进入发酵罐，继续升温。当温度达到95～100℃后，停止搅拌，并将排气阀微开。调节底部及上部的蒸汽阀及排气阀，使压力保持在0.1～0.11MPa之间，严禁超压。（罐压不得超过0.12MPa，防止引起设备的损坏）。实消时间一般为20min。到时间后，关闭所有的阀门,自然冷却10min左右。关闭加热管蒸汽阀，通冷却水打开电磁阀，按冷却键至“自动”状态。当温度降至发酵８0℃后，慢速（150rpm）开启搅拌机，加速降温。当蒸汽阀门关闭以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐内压力降至0.03MPa时，必须间隙开气进气阀，让空气进入发酵罐内，并保持压力在0.03~0.05MPa之间，温度控制在28℃。※取样方法：打开排气阀，用蒸汽消毒20～30min。关闭蒸汽阀，放出少量料液。关闭阀门，再用蒸汽消毒。2.离位发酵罐的灭菌1)实消关闭电源开关，旋下电机接头、温度传感器接头、泡沫传感器接头、加热器接头、pH接头、DO接头；向上取出电机，并妥善放置；取出温度传感器、加热器、pH电极、DO电极。将2.5L培养液从接种口倒入发酵罐内，盖上接种口螺帽。将所有阀门拧紧，补料口用硅胶管两两连上，保持密封。进气口与空气过滤器之间用胶管夹夹住，以防在实消时发酵液倒流至空气过滤器中，造成过滤器失效。取样口、进气口及空气通道必须用夹子加紧。将发酵罐（连支架）平稳的端起，并放入立式灭菌锅内。开启灭菌锅进行灭菌，115℃，灭菌25分钟。注：灭菌时间到后，不要手动排高压蒸汽锅内的蒸汽，必须是高压灭菌锅内的压力慢慢降下来。如果手动排高压灭菌锅内的正气，则发酵罐内的物料会因快速沸腾，造成料液溢出发酵罐；而且，还可能引发酵罐内的压力比高压灭菌锅内的压力高很多，造成发酵罐的破裂。2)冷却：实消结束后，待发酵罐在灭菌锅内自然冷却20min且温度小于80℃后取出。将电极按原位安装于发酵罐顶部，并联接妥电机线。通入空气；正确连接冷却水进、出管道。打开电源开关，调整转速、温度设定值（建议：转速：150rpm；温度：培养温度）※取样方法：打开取样口的胶管夹即可取出样液。取样后，打开取样管空气，将取出管中残留的发酵液吹出，用胶管夹将取样口封闭；然后封闭进入取样管的空气管。★注意：必须轻拿轻放，以免引起玻璃筒损伤和损坏。3.接种、取样①在接种口周围围上酒精棉球，点燃，无菌操作接入种子液。②控制罐压在0.03~0.05MPa，温度为28℃，转速为150rpm。③取样时间各组可根据自己的时间进行取样，培养48h，取样6次。