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细胞培养概述CellCulture细胞生物学教研室授课对象：研究生授课教材：细胞培养，司徒振强、吴军正主编等主编，世界图书出版西安有限公司授课教师：顾芸，王彩萍，刘晓宇带教研究生：一组负责人：彭苏组员：龚佳欢、刘鑫、吴建成、叶永契二组负责人：何春娇组员：王盛燃、张薛杰、查广彬从猛神经再生重点实验室/神经科学系学号姓名组别带教14180014曹澄君超净台1龚佳欢彭苏15180002印丽锋15180004刘珍珍15180007俞盛楠15180009陈晓旭超净台2刘鑫15180010钱秀荣15180012朱晓玥15180020程鑫15180021张晟超净台3吴建成15180022邢凤军15180023殷开治15160001李雯15160003陈美美超净台4叶永契15160006吉磊15160007王守艳15160010俞少露15160015吴丽婷超净台5王盛燃何春娇15160016周琪15160017夏瑜椰15160018杨春朝15160019季兆东超净台6张薛杰15160021王昆15160022陈璐15160023何理15160024胡静静超净台7查广彬15160026华桥15160027单延凤15160028李洁莹15160029张庆婕超净台8从猛15160030陆建锋15160031韦玉芳15160032薛均15160033施维课程内容介绍第一讲：细胞概论-----------------------------------------------4.11（周一）18:30第二讲：细胞株传代培养--------------------------------------4.12（周二）18:00第三讲：台盼蓝染色及细胞计数-----------------------------4.14（周四）18:00第四讲：细胞冻存及种细胞（为真核转染及细胞分裂指数做准备）----------------------------------------------------------4.15（周五）18:00第五讲：真核细胞转染----------------------------------------4.16（周六）18:00第六讲：细胞分裂指数，细胞活力鉴定及细胞固定（为细胞周期测定做准备）----------------------------------------------------------4.17（周日）18:00第七讲：冻存细胞复苏、观察转染效果及讲解细胞周期、细胞活力测定结果----------------------------------------------------------4.18（周一）18:00第八讲：原代细胞的培养--------------------------------------4.19（周二）18:00第九讲：观察原代培养结果，流式细胞实验演示，课程复习和总结----------------------------------------------------------4.21（周四）18:00？WHY据CCTV4报道，13年10月中国台湾地区台北荣民总医院在干细胞研究方面有重大突破，研究人员利用干细胞已分化出网膜和心肌细胞，目前该研究正处于临床实验阶段，未来有望生产干细胞药品有效治疗失明、心脏病等。一口好牙不但能给出一个美丽的笑容，还是健康的标志。但由于疾病或意外事故，我们可能失去牙齿。镶颗金牙吧，有损整体美观。现在好了，科学家成功利用人的尿液衍生的细胞诱导形成干细胞获得再生牙齿雏形。7月30日，这项研究成果刊登在学术期刊《细胞再生》上，同时也引发国际社会广泛讨论。CLS生物治疗的原理是利用自身免疫杀灭肿瘤细胞。2011年诺贝尔医学奖获得者斯坦曼博士在1973年发现了激活免疫系统的关键细胞DC细胞。在20世纪80年代，科学家又培养出了具有肿瘤强杀伤效应的CIK细胞。这两种细胞是肿瘤生物治疗的关键。CLS生物治疗通过体外实验万倍扩增这两类细胞，再输回患者体内实现肿瘤大面积杀伤治疗。CLS多细胞生物免疫治瘤-有效延长生命长度3-5年,保证提升生物质量,实现瘤自我康复.细胞培养的应用细胞培养的应用研究哺乳动物个体发生发育规律研究细胞分化用于制造组织，器官研究基因功能生产转基因动物疾病治疗与治疗性克隆研究细胞癌变机理及新药物的筛选从分子到细胞，我们如何去思考？细胞培养的优点1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动2.可控制：可选择特定的研究细胞种类、性质、阶段可控制调节条件：物理、化学、生物等因素可采用各种研究技术、记录方法：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等。3.样品均一性：来源于同一组织同一种细胞。4.经济、规模和机械化细胞培养的局限性•人工模拟体内环境的技术已经很高,但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。•当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中，必然发生变化。细胞培养的基本条件无菌/灭菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器细胞保存条件：液氮罐实验室安全：生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全设计原则：防止微生物和有害物质的影响，要求环境整洁，空气清新、无尘、干燥。细胞培养室按功能可分为准备室，缓冲室，培养室。冰箱超净台倒置显微镜离心机载物台橱柜物品柜培养箱恒温箱显微镜缓冲室培养室准备室工作台水池试剂柜干燥箱CellBiologyLab净化工作室------我国药品生产洁净室（区）空气洁净度标准-------洁净度级别尘粒最大允许数/立方米尘粒最大允许数≥0.5um≥5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000NA15细胞培养室初级过滤高级过滤无菌空间超净工作台SterileworkarealaminarflowcabinetclassII-HEPAfilter(0.3µm)-UV250-270nmIncubator(humidCO2incubatorrecommended)CO2incubator，37oC，AppropriateCO2大容量高压灭菌器全自动手提式灭菌器湿热灭菌装置自动双重纯水蒸馏器纯水仪细胞培养用水装置酶标仪微孔板震荡器水平离心机倒置显微镜invertedmicroscope水浴箱干燥箱29LiquidN2Long-termstorageofcells液氮罐移液器滤器大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。Zeiss滤器(过滤除菌)：培养基过滤除菌装置负压正压Filtrate：suckfilter0.22umpressfilter0.22umMediasterilizationthrougha0.22µmmembranefilterassembledinafilterholderA:ThevacuumpumpB:GlassorplasticpipettesFiltrate培养瓶、培养皿实验器材的清洗和灭菌清洗的重要性1.除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等2.使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。不要让污染了的器皿变干！！灭菌的重要性除去微生物污染一、玻璃制品的清洗清洗工作包括；浸泡、超声、浸酸、冲洗四步。1、浸泡；器皿在加中性洗涤剂的液体中浸泡数小时。新购的玻璃器皿必须彻底清洗。2、超声；在加有中性洗涤剂的超声槽中超声30min。3、冲洗，用水冲净，稍凉干后浸酸。4、浸酸-清洁液，一般浸泡6h以上。以配制中等强度清洁液为例；重铬酸钾120g、浓硫酸200ml、蒸馏水200ml。5、冲洗，及时冲净（不挂水为止）6、烘干。三：金属器皿金属器皿不能泡酸，洗涤时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。二、塑料及橡胶制品用水浸泡→超声→冲洗→浸酸（1%盐酸，6h）→冲洗→烘干。四、物品的包装及消毒1、洗净、烘干的物品应及时包装，常用牛皮纸、棉布、铝盒、以及专用金属消毒筒等。物品应标明品名、日期。2、消毒；⑴用压力蒸气灭菌，玻璃器皿一般15压力（ibf)-121℃.压力维持30min。培养用的液体以及塑料、橡胶制品常以10ibf-115℃，维持10min。⑵过滤除菌；有塑料、不锈钢微孔滤膜滤器，用正压过滤除菌。塑料的一般为针式滤器，直径25mm和50mm两种。不锈钢微孔滤膜滤器有500和1000ml两种。除菌用微孔滤膜，孔径为0.22um。注意滤完后要检查滤膜是否完整。⑶电离辐射灭菌；核素产生的r射线或电子加速器产生的加速离子辐射物品杀细菌和微生物的方法。⑷环氧乙烷，化学灭菌。培养用液体外培养离不开细胞在体外生存和生长的各种液体环境-培养用液，因此其各种成份必需严格选择，有严格的制备操作过程。培养用液主要包括:培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清、PH调整液、抗生素液等。所有用液均除菌后标明名称、日期、PH值，在适当温度下贮存。一、水与缓冲液（一）水:是培养用液最主要的溶剂，是细胞赖依生存的环境。对水质要求高；三蒸水、去离子水、超纯水。此外，水的贮存也很重要；贮存于密封、洗净玻璃并内，时间2W，最好是现制现用。（二）缓冲液由弱酸/弱酸强碱组成的盐或弱碱/弱碱强酸组成的盐如碳酸/碳酸氢钠，磷酸二氢钠/磷酸氢二钠。细胞生活环境中无机盐种类很多，因细胞、组织的不同而不同，在所有细胞中无机盐都以离子状态存在。培养用液二、培养基（一）、营养成分：1、氨基酸：主要需要以下12种必须氨基酸，它们都是L型的。2、单糖：六碳糖是主要的能源，也是合成氨基酸的原料，吸收能力最强的是葡萄糖、半乳糖最低。3、维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，因此是必不可少的。4、无机离子和微量元素：细胞生长过程中除需要钠、钾、钙、镁等基本元素外，还需要一些微量元素，铁、锌、锰、钼等。培养用液培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液（二）、促生长因子及激素体内生长需要因子的刺激、调节，体外同样需要，愈来愈多的实验证明各种激素、生长调节因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。（三）、渗透压细胞必须生活在等渗的环境中，大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。人血浆的渗透压是290mOsm/kg,可视为培养人体细胞的理想渗透压。对于大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260~320mOsm/kg的范围内都适宜。（四）、pH大多数细胞的适宜pH为7.2~7.4，偏离此范围对细胞产生有害影响，培养基应具有一定的缓冲能力。造成培养基pH波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2,在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为了解决这一问题，合成培养基中采用了NaHCO3-CO3缓冲系统，并采用开放式培养的方式，使细胞产生的CO2及时逸出培养器皿，再通过稳定调节温箱中的CO2气体的浓度（5%），使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。NaHCO3+H2ONa++HO–+H2O+CO2（五）、无毒、无污染体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质无任何抵抗力。因此，培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染。培养基分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好。缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。（六）、培养基的种