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第一章基因工程第二节基因工程的原理和技术基因工程的基本原理：让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效表达。基因工程的基本操作步骤：1、获得目的基因2、形成重组DNA分子3、将重组DNA分子导入受体细胞4、筛选含有目的基因的受体细胞5、目的基因的表达一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________请举出三个以上的例子2、获取目的基因的方法（1）、从基因文库中获取目的基因。（2）、化学合成例:利用PCR技术扩增目的基因----适用于目的基因的序列为未知的----适用于目的基因的序列为不是很大且已知的获取目的基因的方法1）鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离受体细胞(直接分离法)2）反转录法：目的基因的mRNA单链DNA双链DNA(即目的基因)反转录合成(人工合成法)获取目的基因的方法3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成(人工合成法)获取目的基因的方法一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________请举出三个以上的例子2、获取目的基因的方法（1）、从基因文库中获取目的基因。（2）、化学合成例:利用PCR技术扩增目的基因----适用于目的基因的序列为未知的----适用于目的基因的序列为不是很大且已知的KaryB.MullisPCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。(2)利用PCR技术扩增①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板(已知基因的核苷酸序列)四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物⑥过程：a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链PCR原理PCR原理１变性PCR原理１退火PCR原理１延伸PCR原理２变性PCR原理２退火PCR原理２延伸PCR原理３变性PCR原理３复性PCR原理３延伸人工合成：若基因_____，核苷酸序列又______，则可用此法。较小已知①用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。②用_____________切断目的基因，使其产生_________________。2、形成重组DNA分子③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同表达载体应包括：启动子目的基因终止子标记基因转录的起点转录的终点3、将重组DNA分子导入受体细胞将目的基因导入植物细胞方法将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞基因工程的受体细胞有哪些？如何选择？如何导入？3.不同受体细胞导入的方法不同：（1）植物细胞：农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法基因枪农杆菌转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。基因枪法：将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低，另外这种方法也用于基因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。这一方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因。基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。花粉管通道法:在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。（2）动物细胞：显微注射法在显微镜下，用一根极细的玻璃针(直径1～2微米)直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔，使用这种方法进行外源基因整合成功率约为10％（3）以大肠杆菌为受体细胞：•将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性•感受态细胞大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA,处于这种状态的细胞即感受态细胞常以微生物作为受体细胞的原因：繁殖快、结构简单通过标记基因，进行筛选和检测•导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。4、筛选含有目的基因的受体细胞•怎样进行检测？举例说明检测—①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交5、目的基因的检测和表达个体水平的检测：性状的表达分子水平的检测：核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链探针(序列已知，单链)待测核苷酸序列(单链)检测—①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交5、目的基因的检测和表达个体水平的检测：性状的表达分子水平的检测：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。通过基因工程得到抗虫棉，怎样证明抗虫基因已经在棉花细胞中表达？总结：基因工程的操作流程及要点步骤一•获取目的基因（化学合成、基因文库）步骤二•形成重组DNA分子（同种限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因）步骤三•将重组DNA分子导入受体细胞：受体细胞不同导入的方法也有差异；常用原核生物作为受体细胞步骤四•筛选含有目的基因的受体细胞：以质粒上的标记基因是否表达为依据步骤五•目的基因的检测与表达：分子水平的检测（方法：DNA分子杂交、抗原—抗体杂交）；个体水平的检测1为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其水分利用率提高了20%。这项技术的遗传学原理是A．基因重组B．基因突变C．基因复制D．基因分离巩固练习【答案：A】2利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测A．是否有抗生素产生B．是否有目的基因表达C．是否有抗虫的性状出现D．是否能分离到目的基因巩固练习【答案：C】3水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中天冬氨酸、甘氨酸和丝氨酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是A．促使目的基因导入受体细胞B．促使目的基因在受体细胞内复制C．使目的基因容易被检测出来D．使目的基因容易成功表达巩固练习【答案：C】4根据mRNA的信息推出获取目的基因的方法是（）A、用DNA探针测出目的基因B、用mRNA探针测出目的基因C、用mRNA反转录形成目的基因D、用PCR技术扩增mRNA巩固练习【答案：C】5PCR技术扩增DNA,需要的条件是()①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A、①②③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥巩固练习【答案：A】6获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（）A、从基因组文库中获取B、从cDNA文库中获取C、从含目的基因生物细胞中获取D、利用PCR技术获取巩固练习【答案：C】9、下图是利用基因工程办法生产人白细胞干扰素的基本过程图，据图回答：（1）①过程需要_______________酶的参与。（2）②物质是从大肠杆菌分离出的_________________。其化学本质是________________，它必须能在宿主细胞中___________________________。(3)③过程表明目的基因______________________7下列高科技成果中，根据基因重组原理进行的是（）A、我国科学家袁隆平利用杂交技术培育出超级水稻。B、我国科学家将苏云金杆菌的某些基因转移到棉花体内，培育出抗虫棉。C、我国科学家通过返回式卫星搭载种子培育出太空椒。D、我国科学家通过体细胞克隆技术培育出克隆牛。巩固练习8有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制性内切酶只在获得目的基因时才使用B、DNA连接酶可以切断磷酸二酯键C、质粒都可以做载体D、基因工程都能定向改变生物的性状巩固练习