实验七 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

生物化学与分子生物学实验实验七聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质生物化学与分子生物学实验掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用实验目的生物化学与分子生物学实验聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。实验原理生物化学与分子生物学实验由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。Bis：交联剂过硫酸铵(AP)：引发剂，提供自由基，引发聚合反应四甲基乙二胺(TEMED)：催化剂,加快引发释放自由基的速度聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应：生物化学与分子生物学实验1.浓缩效应分离机制：凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7；分离胶pH=8.9缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)；凝胶中Cl-(快离子)；Pr-介于二者之间电位梯度不连续生物化学与分子生物学实验成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.7浓缩胶Cl-(快离子)6.7大分离胶Cl-(快离子)8.9小有效迁移率=迁移率解离度生物化学与分子生物学实验电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩生物化学与分子生物学实验2.分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率3.电荷效应电荷量不同，迁移率不同。生物化学与分子生物学实验实验仪器及试剂电泳装置稳压电源盘状电泳槽生物化学与分子生物学实验毛细滴管刻度吸量管灯泡瓶玻璃管和橡胶帽微量移液器注射器和长针头脱色摇床生物化学与分子生物学实验TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。过硫酸铵(新鲜配制)染色液：0.1％溴酚兰液洗脱液：7％醋酸其他试剂：见下表贮存液的配制。Acr和Bis：棕色瓶保存生物化学与分子生物学实验贮存液100ml溶液中的含量pH工作溶液配制的体积比11NHCl48.Oml；Tris36.6克TEMED0.23ml8.9分离胶制备：1份1号，2份2号，1份水；抽气后加入4份3号；凝胶浓度7％；pH=8.92Acr28.0克；Bis0.725克3过硫酸铵0.14克41NHCl48.Oml；Tris5.98克TEMED0.46ml6.7浓缩胶制备：1份4号，2份5号；抽气后加入4份6号；凝胶浓度2.5％；pH=6.75Acr10.0克；Bis2.5克6蔗糖40.0克7电泳槽缓冲液：Tris0.60克甘氨酸2.88克8.3用时可稀释10倍500ml可供12根电泳管生物化学与分子生物学实验实验步骤1.每人取电泳管1支，加1-2滴40％蔗糖于橡胶帽内，堵住电泳管底部，塞紧。2.制备分离胶：（可灌胶12支）1号2ml2号4ml水2ml在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡；加3号8ml，混匀备用最后加生物化学与分子生物学实验用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口1.5cm处，然后在距胶面约1cm处，沿玻管壁缓缓加入3-5mm高的水层，垂直静置至再次出现界面时表明凝胶已经聚合。3.分离胶的灌制生物化学与分子生物学实验4.制备浓缩胶：（可灌胶12支）4号1ml5号2ml6号4ml在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡；加3号1ml，混匀备用最后加5.吸去分离胶上层的水，灌浓缩胶于分离胶上，高约1cm，然后沿管壁小心加入蒸馏水高约0.5cm。垂直放置至成胶。生物化学与分子生物学实验6.成胶后，吸干上层覆盖水；拔去玻棒塞，吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气。7.样品制备血清：1-2滴40%蔗糖：1滴0.05%溴酚兰：1滴于一小试管中混匀备用生物化学与分子生物学实验倒入上槽缓冲液盖过玻管上端，排出管内的空气，检查有无漏液。用微量加样器吸样品液30ul，加在浓缩胶上。8.上样9.电泳上槽——负极；下槽——正极稳流：1.5mA/管，3min2.5mA/管，约1h，至玻管3/4处生物化学与分子生物学实验10.剥胶电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。生物化学与分子生物学实验11.固定和染色用7%醋酸固定3min；用0.1%溴酚蓝碱性液染色5min（染色液回收）；用洗脱液(7%醋酸)漂洗脱色12.观察结果，描出血清电泳区带图谱，分析有无异常生物化学与分子生物学实验实验结果+—生物化学与分子生物学实验丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。注意观察实验现象：分界面，浓缩效应.溴酚蓝染色﹑脱色﹑染液回收。固体胶切忌倒入水池。注意事项生物化学与分子生物学实验思考题1.圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高？2.圆盘电泳灌胶时表面要加盖一层水，为什么？