儿童激素耐药型与激素敏感型肾病综合征尿蛋白组学的初步研究

第!!卷第期#$$%年月&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&中国当代儿科杂志’()*+’,*-./01.2)3-45,67!!8,793:#$$%!收稿日期#$$@e$@e!H$!修回日期#$$@e!$e#!!基金项目国家自然科学基金项目%编号F$$$$!@H#F$G!%@F&!作者简介黄爱文#女#硕士#主治医师)主攻方向’小儿肾脏病)现在湖南省第二人民医院儿科#邮编’H!$$$G)!通讯作者何庆南#男#教授#中南大学湘雅二医院小儿肾脏病研究室#邮编’H!$$!!)论著(临床研究儿童激素耐药型与激素敏感型肾病综合征尿蛋白组学的初步研究黄爱文!何庆南!周频!丁娟娟!易著文中南大学湘雅二医院儿科!小儿肾脏病研究室!湖南长沙&H!$$!!$&&!摘&要&目的&筛选和鉴定激素耐药型%E;8E&与激素敏感型原发性肾病综合征%EE8E&尿液中差异表达的蛋白质#寻找可能与肾病综合征激素耐药和激素敏感相关的蛋白质)方法&EE8E治疗前后病例*E;8E*正常对照各例#提取尿液全蛋白#采用双向凝胶电泳建立全蛋白凝胶图谱$银染后用D/3J.93A-.4#5F7$!软件分析差异表达蛋白质点#利用9LQDR[ZBR9E分析获得肽质量指纹图谱#通过93A,-软件进入8’ID数据库#鉴定出差异表达蛋白质)结果&E;8E组与EE8E治疗前组尿液#RV凝胶比较有差异蛋白质点YY个#其中仅出现于E;8E组#H个*EE8E治疗前组#G个$EE8E治疗后组与正常对照组尿液#RV凝胶比较有差异蛋白质点G个#其中仅出现于EE8E治疗后组!!个)对!@个差异蛋白质点进行分析#鉴定出(!R抗胰蛋白酶*转铁蛋白*带异类电荷糖蛋白复合体等%类差异表达的蛋白质)结论&成功鉴定了E;8E和EE8E的尿液中存在%类差异表达的蛋白质#部分蛋白可能是E;8E或EE8E的标志物)!中国当代儿科杂志#@AAB#CC$D%&EWCFEWD!关&键&词&原发性肾病综合征$激素耐药$蛋白组学$儿童!中图分类号&;Y%#&&!文献标识码&L&&!文章编号&!$$@e@@F$%#$$%&$e$FH!e$?$).0(0%$2%%.2-0-*&7$0%$21$*’)*(0/-0/30.4$),0’3-’)$*045$)-0-’%’%4-’)$5*045-)-0’0:))13$*’0/-24$*().-#$&*!%+#.G’&+,*#/+#K.I-0&+#P(#$QC/+*QC/+#J(KAC*!%+O)/435/6357380%9&/65&:#%=A53?3,7#1%:3+9S&/+,7/.3=&6/?#%+65/?13C6A-+&F%5&67#A/+,A/H!$$!!#A&+/%.%’*##GD/&?’A%U+#Y#%XA36D/&?O:3D&&&8+-’$%/’’9+6)/’0:)&[,A-C2:3*2)2.*-)N:-(.04,-.)*/34a.4A)*-(.C4)*.,N()624.*])-(A-.4,)2RA.*A)-)=.%EE8E&3*2A-.4,)2R4.A)A-3*-*.0(4,-)A:*24,/.%E;8E&7;)’3*4-&[,-36C4)*34:04,-.)*A].4..\-43-.2N4,/()624.*])-(EE8E?.N,4.3*23N-.4A-.4,)2-(.430:#E;8E#3*2(.36-(:()624.*%+k)*.3(J4,C0&7U4)*34:04,-.)*A].4.A.0343-.2?:)//,?)6)O.20TJ432).*-?3A.2,*-],R2)/.*A),*36J.6.6.-4,0(,4.A)A%#RV&7[(.A)6=.4RA-3)*.2#RVJ.6A].4.A3**.2])-(2)J)-36D/3J.E3**.43*23*36:O.2])-(D/3J.93A-.4#RVV6)-.F7$!A,N-]34.71.0-)2./3AAN)*J.404)*-%19B&,N2)NN.4.*-)3604,-.)*A0,-A]3A,?-3)*.2])-(9LQDR[ZBR9E714,-.)*A].4.)2.*-)N).2?:93A,-A,N-]34.?3A.2,*8’ID04,-.)*23-3?3A.7)-7.’-&[(.4.].4.YYA0,-A])-(2)NN.4.*-.\04.AA),*,N04,-.)*?.-]..*E;8E()624.*3*2EE8E()624.*?.N,4.A-.4,)2-(.430:#3*2#HA0,-A3*2#GA0,-A,*6:,C44.2)*E;8E()624.*3*2EE8E()624.*?.N,4.A-.4,)2-(.430:#4.A0.-)=.6:7[(.4.].4.GA0,-A])-(2)NN.4.*-.\04.AA),*,N04,-.)*?.-]..*EE8E()624.*3N-.4A-.4,)2-(.430:3*2(.36-(:,*-4,6A#3*2!!A0,-A,*6:,C44.2)*EE8E()624.*3N-.4A-.4,)2-(.430:7V)J(-..*04,-.)*A0,-A])-(2)NN.4.*-.\04.AA),*%YA0,-A)*.3(*.0(4,-)J4,C0&].4.(,A.3*23*36:O.2?:9LQDR[ZBR9E#3*2%-:0.A,N04,-.)*A].4.)2.*-)N).27=*/.7-0*-&8)*.-:0.A,NC4)*34:04,-.)*A])-(2)NN.4.*-.\04.AA),*%YA0,-A)*.3(*.0(4,-)J4,C0&].4.)2.*-)N).2?.-]..*E;8E3*2EE8E()624.*#3*2-(.:/)J(-?.-(.?),/34a.4AN,4E;8E,4EE8E7!=30=*’)(1?)40%’$#@AAB#CC%D&’EWCFEWD&&H)2,*$4-’&14)/34:*.0(4,-)A:*24,/.$E-.4,)24.A)A-3*.$14,-.,/)A$’()62&&原发性肾病综合征%18E&为儿童常见的肾脏疾病#我国小儿肾脏病科研协作组的调查结果显示18E占同期住院泌尿系统疾病患儿的#!c!!)18E的转归很大程度上取决于患儿对糖皮质激素%M’&治疗敏感抑或耐药的情况#激素敏感型肾病综合征%EE8E&病情能够得到有效控制#而激素耐药型肾病(!HF(第!!卷第期#$$%年月&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&中国当代儿科杂志’()*+’,*-./01.2)3-45,67!!8,793:#$$%综合征%E;8E&对M’的治疗表现为无效应或部分效应#病情容易迁延反复#最终发展为终末期肾病)迄今为止#E;8E尚缺乏统一的评判标准#其肾脏病理改变又与激素反应存在不一致性#一般认为对激素敏感的微小病变肾病%9’&也有co!c表现为激素耐药#某些初治对激素敏感的9’可逐渐向系膜增生型肾小球肾炎%9A1M8&和局灶性节段性肾小球硬化%BEME&转变#进而转为继发性激素耐药!#oH)目前尚无特异性实验室指标及缺乏分子标志物来诊断E;8E#而应用蛋白组学技术进行EE8E和E;8E尿液蛋白质分析#可能有助于发现特异性的分子标志物)CQ资料与方法C7CQ主要仪器D/3J.93A-.4#5F7$!软件%美国L/.4A(3/1(34/3)3I),-.(公司&#垂直平板电泳系统%美国I),R;32公司
,].46,,aDDD扫描仪%U9Ln公司&#LC-,N6.\9LQDR[ZB质谱仪%德国I4Ca.4公司&)C7@Q主要试剂1TFR!$线性D1M干胶条*DVB?CNN.4购自美国1(34/3)3公司#十二烷基硫酸钠*二硫苏糖醇*G@@HR!B[透析袋*碘乙酰胺为E)J/3公司产品#丙烯酰胺购自I),R;32公司#乙腈%’L8&购自B)A(.4公司#三氟乙酸%[BL&购自9.4a公司#胰蛋白酶购自14,/.J3公司)C7EQ收集标本入选的18E患儿依据中华医学会儿科学分会肾脏病学组制定的诊断标准!#分为如下F组#每组各例#$EE8E%治疗前&’此组尿液标本在进行激素治疗前收集#尿蛋白定性%‘‘‘&o%‘‘‘‘&#定量均每#H(#$/J_aJ#所有患儿均接受规则激素治疗#经随访符合下述激素敏感标准!)%EE8E%治疗后&’糖皮质激素足量%泼尼松每日!7o#/J_aJ&治疗$@周#尿蛋白转阴者且激素减量后尿蛋白持续为阴性者)&E;8E组’泼尼松足量治疗@周后尿蛋白仍阳性者))正常对照组’例健康儿童#其性别*年龄同18E组相匹配)%*&两组病例在足量激素减量后#周内收集尿液标本)各组性别*年龄差异无显著性#各组在收集尿液标本前!周未患感染性疾病#未服用免疫抑制剂)参照相关文献!#Y收集清洁中段尿液#按!h!$体积比加入蛋白酶抑制剂%!$/9,6_Q19EB及$7/,6_QV[L溶液&#标本收集后F$/)*内在Hl下H$$$4_/)*离心!(#取上清#用无菌塑料试管分装/Q后立即eG$l冻存备用)C7WQ尿液蛋白质组样本的制备同类病人每份标本各取/Q混匀#不预先去除尿液中的白蛋白以防止有意义蛋白质分子的同时丢失#用冷丙酮沉淀浓缩蛋白质#透析去离子#蛋白质干粉溶解于!$$!Q裂解液中)I4,32N,4.法蛋白定量)C7DQ双向电泳的步骤第一向固相0T梯度等电聚焦D1MRLQ[主要按D1M0(,4等电聚焦系统指南进行!Y)第二向EER1LMV凝胶电泳按照蛋白质电泳技术操作步骤进行#随后按1(34/3)3公司的蛋白质银染试剂盒的操作手册进行硝酸银染色)扫描仪摄像)C7SQ凝胶图像分析用D/3J.93A-.4#5F7$!分析软件按1(34/3R)3公司的操作手册进行分析#找出差异蛋白质)每组各选其中Y个差异蛋白质点)C7GQ胶内酶切消化将所选择的胶点用!7//切胶笔切下#置于V00.*2,4N管或%Y孔1’;板中#并记录点号及相应的位置$加$!QT#Z洗两次#!$/)*_次#加乙腈$!Q脱水至胶粒完全变白#真空抽干/)*$加!$/9二硫苏糖醇%!$!Q!9[[#%%$!Q#/98THT’ZF配制&#$!Q#Yl水浴!($冷却到室温后#吸干#快速加/9碘乙酰胺%!Q!9DL9#%H!Q#/98THT’ZF配制&#$!Q#置于暗室H/)*$依次用#/98THT’ZF*$c乙腈溶液和纯乙腈洗#乙腈脱水到胶粒完全变白为止#真空抽干/)*$将$7!!J_!Q的酶储液以#/98THT’ZF稀释!$倍#每V1管加#!Q#稍微离心一下#让酶液充分与胶粒接触#Hl或冰上放置F$/)*#待溶液被胶块完全吸收#加#/98THT’ZF!$o!!Q置FGl#消化过夜$加入#c[BL终止反应#使[BL终浓度为$7!c#振荡混匀#离心)C7\Q肽质量指纹图谱鉴定蛋白质取!!Q样品与!!Q饱和基质上清液%3R氰基RHR羟基肉桂酸的含$7!c三氟乙酸的$c乙腈水饱和液#!/J_/Q&混匀后#系统将蛋白质点样到特定的材料的表面%9LQDR[ZB&上#获得肽质量指纹图谱%19B&)应用93-4)\E).*.%(--0’__]]]7/3-4)\RA).*.7,/&93A,-软件搜索9EI和8’ID*4的19B数据库#搜索到的蛋白质分数高于YH分#认为差异有显著性%0d$7$&#且取其最高分为最佳匹配)(#HF(第!!卷第期#$$%年月&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&中国当代儿科杂志’()*+’,*-./01.2)3-45,67!!8,793:#$$%@Q结果@TCQ各组尿液标本@5U!凝胶图谱和平均蛋白质点数本实验收集EE8E#E;8E及正常儿童尿液总蛋白#使用固相梯度D1M胶条进行第一向等电聚焦#第二向使用浓度为!#cEER1LMV胶#并对双向电泳条件和上样量进行了优化#银染后获得图像清晰*分辨率高*重复性好的固相0T梯度双向