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生物工艺学胡庆森qshu@jiangnan.edu.cn生命科学学院本课程的主要内容和考核方式菌种选育（第2章）微生物代谢调节（第3章）微生物培养基及灭菌（第4、5章）种子扩大培养（第6章）发酵工艺控制（第7章）平时成绩：20%（出勤率、课堂表现、课后习题）期末考试：80%（闭卷，平时上课讲解的重点内容）主要内容通过理解所学的知识，达到重点内容熟练掌握，具有初步分析和解决本专业问题的能力。绪论（第1章）第一章绪论第一节生物技术的概念与特点IECDO给出的定义：应用自然科学和工程学的原理，依靠生物作用剂（biologicalagents）的作用将物料进行加工以提供产品或用以为社会服务的技术。特点：①一门多学科、综合性的科学技术②反应过程中需要生物催化剂的参与③最终目的是建立在工业生产过程或进行社会服务。(Moo-Young,1985)生物学化学工程学生物技术1.2生物技术的发展历史（四个阶段）代表性的产品或技术:在石器时代后期，我国人民利用谷物酿酒，公元10世纪,我国就有了预防天花的活疫苗。公元前221年（周代后期），作豆腐、酱和醋，另外还有泡菜、奶酒、干酪等制作以及面团发酵、粪便和秸杆的沤制等。特点知其然不知其所以然，有关实践没有上升到理论，更不能以理论来指导提高、实践。经验生物技术时期（从人类出现到19世纪中期）近代生物技术建立时期（19世纪50年代至20世纪40年代）这一时期的诞生与显微镜的发明、微生物的发现和微生物学的问世密切相关。1683年，荷兰人列文虎克(A.vanLeeuwenhoek)制作显微镜，人们认识到微生物的存在。Leeuwenhoek在1683年寄给英国皇家协会信的部分内容。A和B代表杆菌，C和D表示菌体运动的轨迹，E代表球菌F代表长杆菌，G代表螺旋菌，H代表一簇球菌1863年“微生物学之父”法国人巴斯德（L.Pasteur）指出所有的发酵都是微生物作用的结果。（Pasteurization；利用减毒的病原菌制成疫苗）1881年细菌学奠基人德国的科赫（R.Koch）首先用染色法观察细菌形态（固体培养皿表面划线培养获得单孢子菌落；发现结核菌）。1926年美国的萨姆纳（J.B.Summer）首次证实结晶脲酶是蛋白质划线分离获得单菌落青霉素抑菌实验1928年英国人弗莱明（A.Fleming）发现青霉素产品特点：以厌氧发酵居多，不少工业过程陆续出现产物多数属于微生物初级代谢产物，主要与细胞生长相关的产物及能量代谢相关的副产物。产品类型：有机溶剂乙醇、丙酮-丁酮-乙醇、丙酮-丁酮-异丙醇多元醇甘油有机酸乳酸、乙酸、丙酸、丙酮酸、柠檬酸、富马酸酶制剂淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、凝乳酶疫苗卡介苗该阶段的特点：微生物学通过对微生物形态和生理的观察与研究建立的时期，为工业、农业、医学开始做出比以往更多的贡献，出现了不少新品种和新成就。早期以固态发酵生产近代生物技术的全盛时期（20世纪40年代-20世纪70年代）出现于20世纪40年代，是以青霉素的工业开发获得成功为标志。最初采用表面培养生产，以麸皮为培养基，发酵效价单位约为40u/mL，纯度20%，收率30%。1943年，美英科学家研究出5m3的机械通风发酵罐，采用深层培养法使发酵效价为200u/mL，纯度60%，收率75%。机械搅拌和通气装置的发酵罐代替扁瓶或锥形瓶不久其他抗生素如链霉素、新霉素相继问世。很快又发展了其他发酵产品，如维生素（19世纪40年代）、氨基酸（19世纪50年代）、酶制剂（19世纪60年代）、核苷酸、多糖、有机酸。本阶段形成两项技术：固定化酶（细胞）技术和生物转化技术。固定化技术应用实例生物转化技术在两步法生产Vc中应用现代生物技术建立和发展时期（从20世纪70年代末开始）以分子生物学理论为先导，基因工程的技术能作为生物技术新产品的一项开发手段和关键技术算起。1974年美国人H.W.Boyer和S.N.Cohen在实验室内首次成功获得基因的克隆。1944年美国微生物学家O.T.Avery证明了基因的化学本质是DNA。1953年美国J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA双螺旋模型。1958年F.H.C.Crick发现中心法则。1961-1965M.W.Nirenberg，R.W.Holley,H.G.Khorana完成常见氨基酸密码子的破译。1982年美国Eli-Lilly药厂第一个基因工程产品胰岛素投入市场。1.目的基因的获取2.载体的选择3.目标基因与载体NDA的体外连接4.重组体DNA导入受体细胞5.重组细胞的筛选和鉴定基因工程的基本操作步骤基因工程产品发展概况目前，世界上已经批准上市的基因工程药物就有几十种，集中在多肽或蛋白质的生化药物中，如：胰岛素、人生长激素等。部分利用基因工程技术研制的产品人胰岛素人生长激素(GH)表皮生长因子(EGF)肿瘤坏死因子白细胞介素-2(IL-2)尿激酶原猪生长激素(PGH)牛生长激素(BGH)纤维素酶,-干扰素乙型肝炎疫苗集落刺激因子(CSF)红细胞生成素(EPO)抗血友病因子组织溶纤原激活剂(t-PA)这一时期出现了一项属于细胞工程的巨大成就-单克隆抗体技术。这一技术的基础是细胞融合，基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。脾脏淋巴细胞骨髓瘤细胞繁殖快速产生目的抗体基因杂交瘤细胞繁殖快速+产生目的抗体基因动、植物细胞培养技术的应用：动物细胞生产单克隆抗体、糖蛋白干细胞的培养杂交技术在动、植物生产中应用：“三系杂交水稻”转基因动、植物的研究和开发：“金稻米”“克隆羊”、“克隆牛”、“克隆鼠”生物技术发展现状与趋势第二章微生物代谢调节第一节微生物初级代谢调节代谢调控机制分为两种主要的类型：酶活的调节和酶合成的调节。快速相对缓慢酶活的调节酶合成的调节活化或钝化诱导或阻遏微调粗调本章以下内容围绕微生物细胞如何实现这两种调节方式展开论述蛋白质水平基因水平代谢调节的部位第一节酶活性调节1.定义：蛋白质分子中的一个或者多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或者解开，使其活性改变的作用。2.化学基团：磷酸基、甲基、乙基、腺苷酰基。蛋白质的共价结合部位：一般为丝氨酸残基上的羟基（-CH2OH）。3.共价修饰的分类：可逆共价修饰、不可逆共价修饰。1、共价修饰酶活性调节可以归纳为以下几种方式：共价修饰、变构效应、缔合与解离、竞争性抑制。a、可逆共价修饰大多数共价调节是通过特定部位的丝氨酸、苏氨酸的侧链（-OH）的磷酸化和去磷酸化来调节的。磷酸化酶酶原：必须在一定条件下，去掉一个或者几个特殊的肽键，从而使酶的构象发生一定的变化才有活性。b、不可逆共价修饰如：胰蛋白酶原的活化是通过肠肽酶在胰蛋白酶原N-端除去一个己肽。变构蛋白(变构酶)至少存在2个结合位点：活性位点+效应物结合位点当效应物与变构酶上的效应物结合位点结合后，酶蛋白的构象发生变化，引起催化中心改变，从而引起酶活性的变化（酶分子结合的效应物不同，产生不同的效应）。2、变构控制（P64-65）变构效应是反馈抑制的理论基础，是代谢调节的有效方法。加正效应物加负效应物不加酶（有活性）酶（无活性）终产物终产物（调节物）结合在效应物结合位点变构酶活性调节示意图3、缔合与解离能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成，蛋白质活化与钝化是通过组成它的亚基单位的缔合与解离实现的。这类互相转变钝化是由共价修饰或若干配基缔合启动的。4、竞争性抑制一些蛋白质的生物活性受代谢物的竞争性抑制。NAD+与NADH葡萄糖+ATP6-磷酸葡萄糖+ADP己糖激酶酶活调节方式小结共价修饰变构控制缔合与解离竞争性抑制酶活调节可逆共价修饰不可逆共价修饰（磷酸化酶）（胰蛋白酶原激活）（天冬氨酸转氨甲酰酶）反馈抑制☞一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率,特点是反应快速。（ATPvsADP;NADHvsNAD）酶合成调节：主要指通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。这类调节是在基因水平（原核生物主要在转录水平上）上进行。第二节酶合成的调节酶合成调节的方式酶合成的诱导酶合成的阻遏分解代谢物阻遏终产物阻遏定义：培养基中某种基质与微生物接触而增加（诱导）细胞中其相应酶的合成速度。按照酶的合成与环境影响的关系来分，若酶的合成速度受基质浓度变化的影响很小，这种酶称为组成酶（如EMP途径中的酶），反之，称为诱导酶（如β-半乳糖苷酶）。1、诱导作用（induction）诱导物：是指能起诱导作用的化合物。诱导物常见的类型：基质、基质衍生物、产物☺诱导作用可以保证能量和氨基酸不浪费，不把它们用于制造那些无用的酶；但是如有需要可迅速合成。安慰诱导物：酶基质的结构类似物，它们不能作为基质被酶代谢，却是出色的诱导物。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，ITPG）诱导作用的分子机制（P70）：Jacob与Monod最先提出诱导作用模型，也叫操纵子模型。RPOSS调节基因启动基因操纵基因结构基因操纵子是一组功能上相关的基因，由启动基因（Promoter）、操纵基因（Operater）、结构基因（Structuralgene）三部分构成。P-RNA聚合酶结合位点；O-调节RNA聚合酶启动或停止转录的调控位点，该基因不能转录和翻译；S-负责编码有关酶蛋白的氨基酸序列；R-调控O，能编码一种蛋白质（阻遏蛋白或阻遏物），该蛋白质专一性强，只能与特定操纵基因结合。乳糖操纵子调控示意图阻遏蛋白具有活性（负调节）（a）无乳糖时（b）有乳糖时2、分解代谢物阻遏（P65-66）定义：培养基中某种基质的存在会减少（阻遏）细胞中其相应酶的合成速率，这种现象称为分解代谢物阻遏。现象：若微生物的培养基中存在一种以上可利用的养分，通常它们会先分解那些最易利用的基质，只有该基质耗竭后才开始分解第二种基质(如大肠杆菌在葡萄糖和乳糖上混合碳源中生长)。葡萄糖效应：葡萄糖降解产物对其他分解代谢操纵子的阻遏作用称为分解代谢物阻遏（降解物阻遏）。☞实质：容易利用的底物在分解过程中产生的中间代谢物或末端代谢物过量积累，阻碍了代谢中某些酶的合成。蛋白质（mg/mL）鸟氨酸氨甲酰基转移酶（U/mL）鸟氨酸氨甲酰基转移酶的分解代谢物阻遏①3’-5’环腺苷单磷酸（cAMP）;②微生物细胞内存在一种蛋白质，称为受体蛋白（CRP）又称为降解物基因活化蛋白（CAP）;③RNA聚合酶和模板NDA的结合以及mRNA合成的开始，都需要有cAMP和CRP同时存在。分解代谢物阻遏作用的分子机制（P70）：☞分解代谢物阻遏是由于cAMP的不足造成的，这是因为支持低生长速率的碳源比迅速利用的碳源造成细胞内更高的cAMP☆大肠杆菌利用葡萄糖造成细胞内cAMP含量过低，cAMP无法与受体蛋白CAP结合成复合物，导致RNA聚合酶无法结合到操纵基因位点，分解乳糖的相关酶基因不能正常进行转录和翻译，因此当葡萄糖存在时，菌株表现为不能利用乳糖。酶合成调节的方式酶合成的诱导(β-半乳糖苷酶)酶合成的阻遏分解代谢物阻遏(二次生长)终产物阻遏（随后讲解）酶合成调节小结反馈调节反馈调节反馈抑制（酶活调节）反馈阻遏（酶合成调节）分解代谢物阻遏终产物阻遏★反馈抑制：指代谢途径的终产物对催化该途径的一个反应（通常是第一个反应）的酶活力的抑制。其实质是终产物结合到酶的效应物结合位点（变构部位），从而影响酶与底物的结合，当然与此相反的有酶活性的激活。☆反馈阻遏：指终产物（或终产物的结构类似物）阻扰催化该途径的一个（或几个）反应中的一个（或几个）酶的合成。其实质是调节基因的作用，这是微生物不通过基因突变而适应于环境改变的一种措施，当然与此相反的有酶合成的诱导。反馈抑制和反馈阻遏的比较终产物阻遏现象：微生物合成代谢过程中某些化合物（如氨基酸、核苷酸）不能无限量生成。终产物阻遏调节机制：阻遏蛋白对转录起始的阻遏作用色氨酸操纵子调节模型(P70)阻遏蛋白无活性☺（a）低浓度色氨酸（b）高浓度色氨酸色氨酸衰减器模型(P71)即使形成转录mRNA,微生物仍可以通过衰减器模型在