鱼类营养生理实验

鱼类营养生理实验技术主要内容•鱼类蛋白质利用率的测定•鱼类对饵料主要成分消化吸收率的测定•鱼类肠管对氨基酸的吸收鱼类蛋白质利用率的测定了解鱼类蛋白质利用率测定的基本原理，掌握鱼类蛋白质利用率的测定方法。食物中蛋白质的利用主要取决于它们所含有的必需氨基酸状况。食物蛋白质越是能够满足鱼类对必需氨基酸的需要，它的利用率就越高。对蛋白质营养价值的评价，目前比较普遍采用的测定与计算方法之一是蛋白质净利用率rNPU（ＮＰＵ：Netproteinutilization）：ｍＩ－（ｍF－ｍFK）－（ｍU－ｍUK）ｍＩrNPU＝式中，ｍＩ为摄入的总氮量；ｍF和ｍU分别为投喂试验饵料的鱼粪便（feces）和尿液（urine）中所含的氮量；ｍFK和ｍUK分别为投喂无蛋白饵料的鱼粪便和尿液中所含的氮量，即内源性氮的失去量。鱼类蛋白质利用率的测定（一）实验装置的建立①养鱼水族箱（A），体积可为３５ｃｍ×２０ｃｍ×３０ｃｍ。每次只容纳１尾鱼进行试验。水族箱应和水源（E）相连接并不断用气泵（D）充气，使试验鱼处于适宜的水环境中。②粪便收集管（Bｃｍ，长度约２５ｃｍ，以一虹吸管和水族箱相连。管内含有氯仿（F），用作粪便中氮的防腐剂；有氢氧化铜（G），用作蛋白质沉淀剂；还在管中部放置一束玻璃纤维（Ｉ），以防止收集的粪便（H）流到管外。③强酸性离子交换树脂柱（Cｃｍ，长约６０ｃｍ，直接和粪便收集管的出口连接，用以吸收溶解性的尿和代谢产物的含氮化合物。鱼类蛋白质利用率的测定测定鱼代谢性的氮排出量（包括粪便中的氮，尿中和代谢产物中的氮），可使用含有蛋白质的试验饵料，以及使用无蛋白质的饲料作对照。试验鱼先在投饵水族箱中定量投饵。投饵量（指饲料干重）为鱼体质量的１９％～２５％，每日３次，准确记录鱼摄食的饲料量。鱼摄食后就移入试验水族箱，收集２４h的排泄物。每次只测定１尾鱼。试验期间调节适宜的流速使水源不断把水注入水族箱，通过粪便收集管和离子交换树脂柱分别收集颗粒状和可溶性的含氮化合物。２４h后停止给试验水族箱注水，将试验鱼从水族箱取出，使水族箱内的全部水都通过粪便收集管和离子交换树脂柱。将粪便收集管内的全部收集物经过滤纸过滤后收集起来以测定其含氮量。离子交换树脂柱吸附的全部含氮化合物用４００ｍＬ／ＬHCｌ溶出后亦用来测定含氮量。（二）蛋白质净利用率测定鱼类蛋白质利用率的测定采用克氏（Kjeldahl）定氮法测定样品含氮量。其方法如下：（三）克氏定氮法１．原理２H２SO４２SO２＋２H２O＋O２C＋O２CO２２H２＋O２２H２ONH２-CH２-COOH＋３H２SO４NH３＋３CO２↑＋２SO２↑＋４H２O２NH３＋H２SO４（NH４)２SO４２H２SO４＋Se２SO２＋H２SeO３＋H２O（NH４）２SO４＋H２SeO３（NH４）２SeO３＋H２SO４３（NH４）２SeO３９H２O＋３Se＋２N２↑＋２NH３（NH４）２SO４＋２NaOH２NH３↑＋２H２O＋Na２SO４NH３＋H２BO３NH４H２BO３鱼类蛋白质利用率的测定采用克氏（Kjeldahl）定氮法测定样品含氮量。其方法如下：（三）克氏定氮法（１）样品的消化。（２）蒸馏。（３）仪器的洗涤。（４）滴定。（５）计算。１.煤气灯２．蒸汽发生器３．长玻璃管４．橡皮管５．小玻璃杯６．棒状玻璃７．反应室８．反应室外壳９．夹子１０．反应室中插管１１．冷凝器１２．锥形瓶（１）样品的消化。g试样，然后置１０５℃烘箱中烘至恒温，冷却并称重后，用长镊子夹住纸筒底部突起处，斜向上插入到克氏烧瓶底部，然后连烧瓶一起倒转直立，试样即无损失地倾入瓶底，然后小心取出纸筒，放回称瓶中，称重，计算试样重量。接着，在烧瓶中加入６ｍＬ５ｇ／Ｌ硒－硫酸混合液，轻轻转动烧瓶，使试样全被酸湿润，再加入４ｍＬ３００ｍＬ／Ｌ过氧化氢（最好分几次加入，以防止反应过于剧烈，将试样渍出。操作应在通风橱中进行）。在剧烈反应停止后，投入数粒玻璃珠，置电炉上加热煮沸，直至溶液澄清（无色或只呈微黄色，约需２０～３０min，一般不超过１h）。冷却后，用无氨蒸馏水定容至１００ｍＬ，每种样品需同时做２～３个平行测定。另取２个克氏烧瓶，不放样品，而分别加６ｍＬ硒－硫酸混合液和４ｍＬ过氧化氢作为空白，往后的处理方法与样品相同。鱼类蛋白质利用率的测定采用克氏（Kjeldahl）定氮法测定样品含氮量。其方法如下：（三）克氏定氮法（２）蒸馏。取３只干净的５０ｍＬ锥瓶，加入２０g／Ｌ硼酸溶液１０ｍＬ及混合指示剂４～５滴，这时瓶内液体应呈紫葡萄色，用小烧杯盖好备用。若瓶内液体呈绿色，表示烧瓶不干净，应弃去溶液重洗。克氏定氮仪实际上是一套蒸馏装置（见图１－２），蒸气发生器是一容量为２Ｌ的平底烧瓶，其中装入加有数滴浓硫酸和数滴沸石的蒸馏水（最好加数滴甲基橙指示剂，以便随时观察瓶中的水是否呈酸性）。克氏定氮仪在使用前需用蒸气洗涤１０min左右，然后将一只装有硼酸液和指示剂的小锥瓶置冷凝管下，调节锥瓶的高度，使冷凝管末端浸入液面以下，继续蒸馏１～２min，如接受液不变色，表示仪器已洗净，可以应用，移去硼酸液，用蒸馏水冲洗冷凝管口，开始样品蒸馏。转动三通活塞。将蒸气放空，由于仪器夹层温度降低，产生负压，反应室中的残液被倒吸入夹层中，旋开排液管螺旋夹，排出夹层中的废液；转动三通活塞，导通蒸气，这时蒸气经过夹层由排液管排出，将盛有１０ｍＬ２０g／Ｌ硼酸液的小锥瓶置冷凝管下端，并使冷凝管尖端浸入液面以下，提起小玻杯里的棒状玻塞，用移液ｍＬ至反应室中（如果样品含氮量低，样品液可改为ｍＬ）。用少量蒸馏水洗涤数次，使沾于小玻杯或玻塞的样品消化液全部进入反应室，塞回玻塞，拧紧排液管螺旋夹，在小玻杯中加３ｍＬ饱和氢氧化钠，然后慢慢地稍提起玻塞，使氢氧化钠溶液缓慢地流入反应室中，至玻杯中尚有少量碱液时，塞紧玻塞，加入约３ｍＬ蒸馏水，再依同法放入反应室中，然后计时；蒸馏５min后，降低锥瓶，使冷凝管口离开液面，继续蒸馏约３０s，用少量蒸馏水冲洗冷凝管，移开锥瓶，用小烧杯盖好留待滴定。（３）仪器的洗涤。蒸馏完毕，必须把反应室中的残液吸去、洗净，这时可转动三通活塞，将蒸气放空，则反应室的残液倒吸，流入夹层，至残液刚好倒吸完，又立即导通蒸气，蒸气重又进入反应室，依前法吸去洗液。如是重复３次，打开螺旋夹，排出夹层中的废液，即可进行下次蒸馏。（４）滴定。moｌ／Ｌ盐酸标准滴定，至锥瓶中的液体由绿色刚好转变为淡紫葡萄色，记录标准溶液耗用量。（５）计算。样品含氮量（％）＝（样品滴定值－空白滴定值）×c×n１０００×ＶDＶ×１００m样品粗蛋白含量（％）＝样品含氮量×式中，c为标准酸液的物质的量浓度（moｌ／Ｌ）；n为氮原子的摩尔质量（１４）；ＶD为样品消化后定容体积（ｍＬ）；Ｖ为用于测定的消化液体积（ｍＬ）；m为样品质量（g）。鱼类对饵料主要成分消化吸收率的测定——放射性同位素１４C标记测定法了解养殖鱼类对饵料中某种成分的消化吸收和代谢的特点；掌握应用放射性同位素对饵料成分进行标记和测定鱼类对饵料某种成分消化吸收率的基本方法。应用放射性同位素标记饵料中的某种成分，然后分离提取该成分并制成颗粒饵料投喂鱼类，分别测定鱼体内和饵料中的放射性活度。由于鱼体内的放射性活度能反映鱼对所摄食饵料某种成分的消化吸收量，因而，对比饵料中的总放射性活度和鱼体中的总放射性活度，就可计算鱼对饵料中某种成分的消化吸收率。本实验着重介绍草鱼对放射性同位素１４C标记粗纤维的消化吸收情况。采用本实验技术和方法可以测定其他种鱼类对饵料其他成分的消化吸收情况。四、实验步骤（一）放射性同位素１４C标记粗纤维的制备纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，它由许多β－葡萄糖单位所组成。获得天然的放射性糖类最常用的方法是把绿色植物叶子放在含有放射性二氧化碳的空气中进行光合作用。所以，要得到放射性纤维亦要通过植物进行光合作用，在体内合成放射性的同化产物，然后用化学方法分离和提纯。为此，采用Na２１４CO３和高氯酸作用产生１４CO２，并选择吸收１４CＯ２合成有机物能力较强的凤眼莲幼嫩植株作为进行光合作用的植物材料。本实验采用密闭系统使植物在含有１４CO２的空气中进行光合作用。使用的仪器和方法如下（见图２－１）：（１）电动单向打气泵。（２）放射性二氧化碳反应瓶。其中瓶１装１moｌ／Ｌ高氯酸１５～２０ｍＬ，并加入几滴甲基红作为指示剂，瓶２装Na２１４CO３１００μCi×１０６Ｂq），瓶３为安全瓶。（３）叶室：（a）为钟罩形玻璃罩（容积约为４０００ｍＬ），作为光合作用叶室，其顶端有进出气孔；（b）为有孔的有机玻璃板，每株凤眼莲插在有机玻璃板上；（c）为盛水的玻璃缸，凤眼莲根部浸入其中，使植株处于正常生理状态。（４）回收瓶：其中瓶１′为缓冲瓶，瓶２′和瓶３′盛过量的NaOH溶液。（二）１４C标记粗纤维的提取称取２０g１４C标记的凤眼莲干粉置于３０００ｍＬ大烧杯中，加入２０００ｍＬｍＬ／ＬH２SO４，加热煮沸，同时加入数滴辛醇溶液，以防止气泡过多，并注意水分蒸发。不断用滴管加入沸水，使烧杯内溶液保持在２０００ｍＬ左右。持续沸腾３０min后趁热倒入布氏漏斗中抽滤。抽滤毕，用沸水洗２～３次，每次用水约４００～８００ｍＬ。洗至滤渣不呈酸性为止。再用２０００ｍＬg／ＬNaOH溶液把漏斗内的滤渣洗回原大烧杯中，并依法进行碱处理。碱处理后，滤渣用沸水洗至不ｍＬ／ＬH２SO４４００ｍＬ分为２～３次洗滤渣，以除去溶于酸中的某些金属沉淀，接着用沸水分数次洗去残余硫酸直至不呈酸性为止。最后，用１００ｍＬ９５０ｍＬ／Ｌ乙醇洗滤渣，再用２００ｍＬ乙醚分两次滤洗，所得的滤渣就是粗纤维，将它置于１０５℃烘箱中烘干备用。提取的粗纤维的抽样用常规生化分析方法试验，证实与粗纤维共存于凤眼莲植物体中的蛋白质、脂肪、糖类等物质均已清除。（三）草鱼对粗纤维消化利用的测定将提取的１４C粗纤维干粉与普通面粉按７∶３的比例加水并加热混合调匀，制成各种大小的颗粒饵料，烘干备用。对照组的颗粒饵料采用１４C标记的凤眼莲干粉和面粉依同法制成。试验用的草鱼可用大、中、小三种规格。大鱼组体长１２０～１５０mm，体重３５～８０g；中鱼组体长９０～１１５mm，体重１６～２６g；小鱼组体长７０～９０mm，体重６～１５g。草鱼驯养约１０d，以３～５尾为一组，按体重１%的投饵量投给标记颗粒饵料。第一批试验，投饵１次，２４h后测定消化吸收率；第二批试验，每天投饵１次，连续２d，然后测定消化吸收率；第三批试验，每天投饵１次，连续３d，然后测定h后测定消化吸５～２２℃。取样测定的草鱼经充分流水冲洗后，吸干体表水分，测量体长和体重，刮取鳞片，用已知重量的滤纸吸取新鲜血液样品。然后解剖，将肌肉、骨骼、肠、鳃、肝胰脏、肾脏、前肠含物、后肠含物等分离并分别置于培养皿中，在８０～１００℃烘箱中经６h烘干，研磨成粉状。各取５０mg（各器官一般有２个平行样品，不足５０mg的样ｍＬ闪烁液，充分摇匀，用液体闪烁测定仪测定放射性活度（以每分钟的脉冲数cpm或c/min：countsperminute）或以每秒衰变次数Ｂq表示cpm（c/min）是不规范的单位，但在某些实验中仍在应用，此书暂保留。cpm÷Ｅ％（通常为６０％，指仪器效率）＝dpm（一个核衰变数）；dpm÷６０＝dps；１dps=1Bq。。同时，吸取草鱼取食标记颗粒饵料后排出的粪便，烘干磨碎，测定其放射性活度。鱼类肠管对氨基酸的吸收了解鱼类对氨基酸的吸收过程以及影响氨基酸吸收的主要因素，掌握研究鱼类小肠对氨基酸吸收过程的基本操作方法。氨基酸是蛋白质消化分解的产物，为肠壁所吸收。氨基酸在肠壁的吸收过程和葡萄糖相似。在哺乳类已证明Na＋和氨基酸吸收在机能上是偶联的；代谢毒物（如氰化物）抑制Na＋的流出，同时也抑制肠壁对氨基酸的吸收。有些氨基酸的吸收途径已被了解清楚，例如中性氨基酸有相同的吸收途径，它们的输送是相互竞争的，并且和葡萄糖与半乳糖、单糖的吸收途径相同而相互竞争。碱性氨基酸（如赖氨酸和精氨酸）有另外的吸收途径；而二羧（酸）氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸）没有特别不同的吸收途径，但它们在黏膜细胞内通过转氨作用而产生丙