2018年桑国俊卵母细胞体外培养技术研究-文档资料

一发展背景二试验内容三结果与分析四总结2一发展背景随着胚胎工程技术的深入研究和商业性胚胎移植技术的发展，胚胎需求量日益增加，单纯依靠超数排卵获得体内胚的方法成本高、采胚数量有限，不能满足科研和生产的需要。卵母细胞体外胚生产体系的建立将成为胚胎生产的主要突破点。深入研究卵母细胞体外胚及其冷冻保存的技术机理，建立一套完全在体外培养条件下快速生产和保存胚胎的技术体系，挖掘优良母畜的繁殖潜力，具有巨大的科研价值与现实意义4牛胚胎体外生产技术的累积效率低、技术复杂、实验条件高，受培养基、卵泡液、共培养细胞等因素影响大，还缺乏统一的理论依据和程序化的标准方案，仍处于探索阶段。因此，还必须不断改进和完善胚胎体外培养和生产体系5二试验内容6试验内容…技术路线种公牛鲜精冻精洗涤、离心精子获能母牛超排卵巢采卵IVMIVFIVC桑、囊胚COCs7试验内容…试验设计1卵母细胞体外成熟培养1.1COCs级别对卵母细胞成熟的影响1.2卵泡直径对卵母细胞成熟的影响2卵母细胞体外受精2.1不同离心方法对精子获能和卵母细胞受精的影响2.2不同上浮方法对精子获能和卵母细胞受精的影响2.3精子浓度对卵母细胞受精的影响83胚胎体外培养3.1共培养体系对胚胎发育的影响3.2培养液体积对胚胎发育的影响4冷冻保存COCs的培养4.1GL和EG一步法冷冻对COCs的影响4.2麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响SPSS统计分析9三结果与分析101卵母细胞体外成熟培养1.1COCs级别对卵母细胞成熟的影响选择A、B级COCs进行成熟培养A级COCs63.81%B级COCs47.81%2.01%D级COCs0.00%0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%1COCs级别测定数成熟数成熟率%A级COCs40925563.80aB级COCs42719747.80bC级COCs33982.01cD级COCs18600.00dC级COCs111.2卵泡直径对卵母细胞成熟的影响卵母细胞的成熟率与卵泡直径关系密切，在卵母细胞体外培养过程中，宜选择卵巢发育正常的卵泡采集，而不宜选择发育过大或过小的边际卵泡卵泡直径样本成熟成熟率φ＜2mm64912819.06bφ2～8mm94557861.84aφ＞8mm1473017.07c122卵母细胞体外受精2.1不同离心法对精子获能和卵母细胞受精的影响①二次离心沉淀液：精子活力0.44；获能效果10min最高为0.41，15min为0.32，超活化以15min时最好；受精率为40.19%②二次离心上清液：精子活力0.56；获能效果10min最高0.59，15min时较低为0.585，超活化也以15min时最好；受精率为43.21%洗涤精子活力样本均数冻精解冻活力200.41c2次离心上清液活力200.56a2次离心沉淀液活力200.44b13从试验结果看，宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法，避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路，而直接对上清液进行离心处理，获得了理想的精子洗涤和获能效果沉淀液20min沉淀液15min沉淀液10min上清液20min上清液15min上清液10min组别0.600.500.400.300.20Meanof获能活力0.260.3150.4050.4950.5850.59精子获能活力超活化效果142.2不同温度上浮法对精子获能和卵母细胞受精的影响室温上浮法：20～24℃室温。上浮60min，45min活力最高0.68，对其获能15min后进行体外受精，平均受精率41.40%室温上浮精子活力冻精0.5000g上浮15min0.5667c上浮20min0.6200b上浮25min0.5933bc上浮30min0.6100bc上浮35min0.5467df上浮40min0.5900bce上浮45min0.6800a上浮50min0.6233b上浮55min0.6033bc上浮60min0.5267de上浮60min上浮55min上浮50min上浮45min上浮40min上浮35min上浮30min上浮25min上浮20min上浮15min冻精解冻活力组别0.700.650.600.550.50Meanof精子活力0.52670.60330.62330.680.590.54670.610.59330.620.56670.5015恒温上浮法：CO2培养箱（38.5℃）上浮60min，30min活力最高0.697，对其获能15min体外受精，受精率41.51%恒温上浮精子活力冻精活力0.4800d上浮15min0.5367c上浮20min0.5933b上浮25min0.6067b上浮30min0.6967a上浮35min0.5867b上浮40min0.5300c上浮45min0.4633d上浮50min0.4367d上浮55min0.4100e上浮60min0.3867e上浮60min上浮55min上浮50min上浮45min上浮40min上浮35min上浮30min上浮25min上浮20min上浮15min冻精解冻活力组别0.700.600.500.40Meanof精子活力（38.5℃）0.3830.410.4370.4630.530.5870.6970.6070.5930.5370.4816二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显著（p＞0.05），恒温上浮法的效果略高于室温组。室温随着季节和气候变化而变化，始终处于不稳定状态，精子活力升降比较零乱，而恒温上浮的条件稳定，精子活力升降序列比较整齐，在本试验中的优势虽不明显，如从可控角度考虑，还以恒温上浮法为宜培养液表.xls项目受精率上清液获能精子受精率43.21沉淀液获能精子受精率40.18室温上浮获能精子受精率41.40恒温上浮获能精子受精率41.50受精率获能方法与卵母细胞受精率172.3精子浓度对卵母细胞受精的影响本试验表明精子适宜浓度宜控制在1.0～1.5×106个/ml精子浓度样本COCs卵裂受精率高（300万/ml）3040213733.9637c中（150万/ml）3040319047.3357a低（100万/ml）3038216242.3837b183胚胎体外培养3.1卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响处理样本COCs桑椹胚数囊胚数桑椹胚率囊胚率卵丘细胞组303911133329.0713b8.5063b卵丘细胞+bFF302421484534.9890a10.6343a对照组30308781926.6677c7.2363c19卵母细胞体外胚的发育受到多种因素的影响，培养过程中要摸拟卵母细胞或胚胎在子宫中的条件，给细胞发育创造良好的环境。卵母细胞体外受精过程中明显存在发育阻滞，克服发育阻滞的主要手段是用共培养系统提高卵裂率和桑、囊胚发育率。本试验通过添加共培养物质，较好地克服了体外胚的发育阻滞20处理样本COCs桑椹胚数囊胚数桑椹胚率囊胚率50μl培养液303771233533.1433b9.0680b500μl培养液303881373836.2260a10.2310a3.2培养液体积对胚胎发育的影响21大体积培养液培养的体外胚、桑、囊胚率均较高于微滴培养胚胎培养液的体积与培养系统的稳定性和液体蒸发有关。培养液量小，胚胎平衡培养的微环境差，培养环境易随外围环境的变化而改变；培养液体积过大，胚胎及细胞分泌的生长因子浓度降低，不能有效地促进胚胎正常发育224冷冻保存COCs的解冻培养4.1GL和EG一步法冷冻对COCs的影响COCs在液氮保存1周后解冻成熟培养冷冻保护剂GL和EG均可用于COCs的冷冻保存（p＞0.05），但EG的效果比较好处理冷冻COCs成熟COCs桑椹胚囊胚成熟率桑椹胚率囊胚率GL356118371433.44a10.56a3.86aEG349119381434.46b11.18b4.18b23成熟率桑椹胚率囊胚率244.2麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响以麦管和OPS管作为冷冻载体，二步法玻璃化冷冻COCs。对冷冻1周后的COCs解冻培养OPS管玻璃化冷冻的效果优于麦管法（p＞0.05），而麦管法宜于操作和储存，宜在实际操作中选用麦管法处理冷冻COCs成熟COCs桑椹胚囊胚成熟率桑椹胚率囊胚率麦管法347102331229.84a9.34a3.47aOPS法372118361431.89b9.67b3.80b25成熟率桑椹胚率囊胚率264.3COCs冷冻方法的比较COCs的4种处理方法在成熟培养、桑椹胚发育和囊胚发育方面的趋势基本一致，整体效果的优势序列为EG法＞GL法＞OPS管法＞麦管法玻璃化冷冻效果低于程序化一步法冷冻法。由于玻璃化冷冻的解冻处理程序复杂，建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法处理COCs成熟率桑椹胚率囊胚率一步法甘油组33.441310.56233.8610乙二醇组34.459011.18104.1817平均33.950110.87164.0213玻璃化法麦管法29.83779.34433.4700OPS法31.88809.66573.8003平均30.86289.50503.635127四总结281COCs级别选择A、B级COCs进行卵母细胞成熟培养2卵泡大小选择直径2～8mm卵泡的COCs进行卵母细胞成熟培养3离心法精子获能对第一次离心上清液继续进行低速离心处理，可获得更好的精子洗涤和获能效果。低速离心4上浮法精子获能选用恒温上浮法进行精子洗涤和获能5获能精子浓度用于体外受精的适宜精子浓度为1.0～1.5×106个/ml6共培养系统卵丘细胞+bFF共培养系统能显著促进体外胚的发育297培养液体积大体积培养液培养的桑、囊胚率均较高于微滴培养，大体积培养液更有利于胚胎发育8冷冻COCs解冻培养①冷冻保护剂EG和GL对COCs有良好的冷冻保存作用，EG效果比GL更好②OPS管玻璃化冷冻效果优于麦管法，麦管法宜于操作和储存，建议在实际操作中选用麦管法③程序化一步法冷冻COCs的效果优于玻璃化冷冻法301卵母细胞及体外胚培养：选择2～8mm卵泡的A、B级COCs，清选后移入500μl成熟培养液中培养24h；拣取成熟良好卵母细胞，用上清液二次离心法或恒温上浮法清选和获能的精液体外授精8h，在加入卵丘细胞和bFF的IVC液中继续培养120～140h，拣取桑椹胚和囊胚2卵母细胞的冷冻保存：选择2～8mm卵泡A、B级COCs，用以EG为冷冻保护剂的麦管程序化一步法进行冷冻保存3冷冻卵母细胞的解冻培养：冷冻卵母细胞解冻后，拣取卵丘细胞完整的COCs按照正常卵母细胞进行培养根据以上试验结果，卵母细胞培养、体外胚培养、卵母细胞冻存和解冻培养的操作程序概括为：31主要创新点1系统研究了牛卵母细胞体外培养技术，突破发育阻滞，将卵母细胞体外培养到桑、囊胚2对卵母细胞进行冷冻保存，探索了COCs的冷冻方法，并对冷冻效果进行了评定3建立了新的精子洗涤和获能方法32