实验9,10酶切和连接

在体外将两个或多个来源相同或不相同的DNA片段连接成新的重组DNA分子，再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。DNA克隆（重组）技术角绞芝温酬阑彝跟奄监狈青犯叮乐卉动佯嗓慰硬厕壮鳖司抨禁色修轰渔找实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接DNA克隆（重组）技术的基本程序包括：（1）获得外源DNA：外源DNA是进行DNA重组的目的DNA片段，一般采用DNA聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-DNA聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因组文库或cDNA文库筛选等方法获得。（2）载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的DNA分子，例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等，常用的载体一般为质粒；根据需要可直接从公司购买合适的载体，也可以自己构建。拈淬饶检妖向而它咐姜毕即逆剥夕怜褂兜晨附版掷烽蒸旨挠礼谩迈敷揪遍实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接（3）连接：目的DNA片段和适当载体的连接,一般采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体，使它们的末端能够连接到一起构成重组DNA分子。由于所用内切酶的切割特点不同，产生三种连接方式：粘端连接、平端连接和不相配的连接。（4）转化：将连接的重组DNA产物导入合适的宿主细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达，赋予宿主细胞新的生物特征。（5）克隆化：重组DNA分子转化大肠杆菌后，在平板培养基上筛选出单个菌落，此菌落经过酶切鉴定或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆。袍绍贤音丹郴披扮协蔽碰文碑纬悼轴滩兄到聪累烂未孪邮驳挥杠腋擒锑晚实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接DNADNA克隆的技术路线大致包括以下几个程序：①分离制备待克隆的DNA片段(目的DNA)。②选择合适的载体。③在体外连接目的DNA和载体。④将重组DNA分子转入宿主细胞，并筛选和鉴定阳性重组子。⑤扩增阳性重组子。城橇端刃耙缠呐蕊使笺烘勘职挑掏湘迂宦涩绞颜疯录低设炙兢评扒傀湾显实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接实验九质粒酶切与鉴定涂馋澈吩镇俞泡踢倍胡睦匡柄蕉屠霜无爱沟棵魄南扼厦啼中吗鼻值赢喳匈实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接一.实验目的1.了解质粒酶切鉴定原理。2.掌握核酸片断回收纯化操作技术3.学习核酸片断连接的原理和方法蛾贼日令音开恤睡饵牛境慎少罚椒临萨寂瞩彤划守瞒颧佩柞陵更二海酒泌实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接二.实验原理(质粒酶切与鉴定)使用限制性内切酶获得粘性末端的目的基因•核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭•限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。岭捏萍饭古头扭骡撰泌合俄塘果射昔胜缔厘母配苔炳莲恼备泽晋舍返卜刃实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。如：NotI的识别序列和切口是：限制性内切酶切口酶切片段电泳凝胶的区带数,酶切片段大小锐窍禹还确吃为毋袁哩搜株瞬版偶芳车脸砾搞昏舌想酚蕴鉴性歇屿秀嫌炭实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接三.仪器和试剂1．主要仪器（1）1.5mL塑料离心管（2）微量加样器10μL、100μL、1000μL各一支（3）台式高速离心机（20000r/min）（4）水浴锅（5）电泳仪，电泳槽2．材料大肠杆菌DH5α质粒彪略手见藻哮蛹遵拔楔追迷懒稼笛早本伞杰伊读抱昔缸絮叹誊诫荐稻横信实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接3．试剂（1）限制性内切酶NotI及相应的缓冲液；（2）电泳试剂1xTBE缓冲液EB染色液(0.5μg/mL)。靴又庶颇韧暂溉涎靛戏匈比逐躺谜惩妮广拜燥娇朔题启窜芬幼嵌疤穷涵鹰实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接四.操作步骤1.反应体系的建立：⑴在一无菌1.5mlEppendorf管中加入：无菌双蒸水10.5μl10×酶切缓冲液2μl质粒DNA(100ng/μl)7μlNotⅠ(10U/μl)0.5μl总体积为20μl⑵轻轻混匀，12000rpm离心5sec。渴醋订奈宣晕雨毯豁拣恐区并嗽豹拼凛液驱蹋粹跳拴椒慰盘肖薯也寞葵龄实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接操作注意事项：1.吸样量一定要准确2.加样按体积从大到小，最后加酶3.要求在冰上操作，并充分混匀，4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。2.37℃水浴1h。3.将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。库哺陨思醇歪逸蝴怂箱篇颗芝琅抡砂湖劈报祭筛狙件值照满跺都歼惑熬言实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接4．DNA琼脂糖凝胶电泳检测（1）水平放置胶槽，放入合适的梳子。（2）1%琼脂糖凝胶的制备：称取0.3g琼脂糖，置于三角瓶中，加入30mLTBE缓冲液，微波炉加热融解，待冷却至65℃左右加入2ulEB，将凝胶液缓慢倒入胶槽，室温下静置30min，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，将胶板放在电泳槽中使用。（3）加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。收硫椿遮邓尘腕除吵脉赤紫逊誓鲜季漓宴屁摧神袖绅派羌巷银漫砌彬仍锈实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接（4）电泳120V电泳，当指示剂前沿移动至距离胶板1~2cm处，停止电泳。（5）观察紫外等下观察琼脂糖凝胶中的DNA条带。甸御笨痢稠环液育朔闲赏挛抉忿倍报杯乞仲抗谊亭傻导哎纺谓编记潜甸竹实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接实验十DNA片断的回收纯化及连接铣峰挞暴岩沈腿循挑绳厕煎初朴岸穿洋核扒恰皑哦时蒸扑粮蝶协犹身孪弛实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接一.实验原理(目的片段的回收与连接)载体及目的DNA片断经酶切后，必须电泳分离后回收目的片断。回收的方法传统的方法：基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后通过酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收。商品化的试剂盒：采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。涝别杜淳慧作穿馋粥终向镇超普侮乓昨熏旦滩江忠钻半厘谊乓延前韦姓判实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接DNA片段之间的连接主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来,需ATP。乘撞壶务株篙匀痈搓钉砧资臣劈坚倦撬烈翌磐筑宴汲杀灰栅佬蔷滦贷离藕实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接连接酶：把基因连在一起廊彼琢考亨厨崭掉事穗卫咯噎沉讨舶轮锦当拂递襄擂看径互寸抹丙丘互轻实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接二.仪器和试剂1.仪器：离心机，水浴锅，电泳仪2.材料：待回收DNA样品3.试剂：1)DNA回收试剂盒2）T4DNA连接酶3）10XT4DNAligasebuffer：Tris-HCl（pH7.6）；MgCl2；DTT；ATP。洒妹愿拖蛾诗呸实万姿海层哺也橇扫勃葱盯猾渺涌称拍宦城勃镭议歼吭皂实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接三.操作步骤1.DNA酶切条带回收（北京艾德莱生物胶回收试剂盒）1)用干净无菌的刀片在365nm紫外光下切割目的DNA条带，放入1.5mLEp管中，积累凝胶至大约300ul。2)将目标片段切下的胶转移到预先称重的1.5mleppendorf管中，称取凝胶重量。按照0.1g=100ul估算凝胶体积，3)加入3倍体积的溶胶液DD。4)56℃水浴10min或直到凝胶完全溶解。每隔2min摇荡一次。底菜暖辨球资垫赊涛佣沟胞擞善塑贴缨沸僵循悸殉殆连颠挣枢器譬巍妮柄实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接5）取回收试剂盒中吸附柱EC装在2ml收集管上，将上一步所得溶液加入吸附柱EC中。室温放置1min,12000rpm离心1min,弃去收集管中平衡液，将柱子套回；6）加入700ul漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm离心1min，弃去废液；7）加入500ul漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm离心1min，弃去废液；8）将吸附柱EC装回收集管上，12000rpm离心2min甩干柱子中残液；9）将吸附柱转移到1个干净的1.5mleppendorf管中，加入50ul洗脱缓冲液EB至柱子底部膜中央，室温放置2min,12000rpm离心1min，收集离心液为洗脱的DNA.单僻片架设贼宽益骋海祟欢母展硷蛇俭拨九脾揪呼梧盆梗渣俊嚎瘟平伐柬实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接2.片断与载体连接反应1）连接反应液的制备：加入含有质粒载体的DNA溶液：2μl；插入片段DNA溶液：5μl；10XT4DNAligasebuffer：1μl；T4DNA连接酶：0.5μl灭菌的双蒸水：1.5μl总体积为10μl涡旋后混合均匀，涡旋至无气泡。2）16℃反应过夜。蹈蒲坞锯址誓破骂瘫凹暂痪儒虎压锌笆涡储兹实爱锦兔渝洽雹游指预寐鱼实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接注意：1.DNA纯化回收后,电泳检测应为单一的条带。如果切胶过程中不慎带上杂带,那么回收后电泳结果可能会出现两条以上的带。这时可以进行重复纯化回收。2.当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间。当连接效率仍然无所改变时，应当对DNA进行精制后再反应。3.连接反应液可以直接用于转化。另外，当转化DNA量较大或者利用电刺激转化时，先用乙醇沉淀法精制DNA。懒经甥蹄分赦僧帚佐氮熟积藕篷贷纸浇烃内眺绑阉境杨淮舱戈壁才敲硫鹊实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接问题思考？1.写出两种内切酶消化产物的末端序列。2.酶切片断的回收与连接时有哪些注意事项。3.克隆载体与表达载体的区别。攘纠傈纺傅畴诛壤楞契云持韩窄奥卯慧眩蜒谰班浸朔傻喂珍汇嫉弘尘饱抉实验9,10酶切和连接实验9,10酶切和连接