转基因小鼠制备实验方法

转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10IU)。2、47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5%CO2，37C0培养箱培养。6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5%CO2，37C0培养箱培养。9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。(一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)第二节转基因小鼠的制备在研究心血管疾病时，主要运用显微注射法、基因打靶或基因剔除等方法制备各TGM模型1．显微注射法Gordon等人首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有种外源DNA顺序的TGM。1982年Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”（supermouse）曾引起整生物学界的轰动。这方法外源DNA整合率高、容量，DNA长到50kb仍然有效，实验周期缩短，因而应用较广泛，是制备TGM的一种常用方法。这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（HCG）促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配。次日从输卵管内收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）或放射免疫测定（RIA）等。亦可取胚胎进行分析。显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。我国已有少实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白TGM研究。图23-2显微注射法制备转基因小鼠的程序2．基因打靶与基因剔除技术ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的内胚团（inner,cellmass）中分离出来的。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。基因打靶是指外源DNA片段上带有与受体细胞染色体相应部位的同源序列，导入ES细胞后在同源部位发生定点整合，这种整合是通过同源重组的方式来实现的。Piedrahita等（1992）应用此技术已成功地筛选出携带突变ApoE基因杂交鼠后代。该方法的一般策略如下：如果外源DNA含有突变失活的基因，定点整合人ES细胞染色体后取代原来的同源序列，即是基因剔除。将这样的ES细胞转入小鼠胚胎，便可得到基因剔除的基因小鼠。采用突变基因（mutatedgene）剔除正常基因以产生定位突变（targetmutation）。即首先选定需要突变基因的全部或部分DNA序列，通过插入、修饰、删除或置换等手段落使其突变，成为靶载体，将靶载体导入小鼠ES细胞中，使之与细胞染色体内同源的靶序列进行重组，达到定位突变细胞内该基因的目的。然后在细胞水平和分子水平筛选富集发生突变细胞，并注射到小鼠囊胚腔内，将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中，所产生的子代雄性嵌合鼠与正常雌鼠交配可获得生殖系携带该突变基因的纯合鼠。最后对纯合鼠的表型、基因型、基因表达及其产生等进行分析。目筛选真正发生了同源重组的ES细胞的方案有数种，如正负双向选择法（positiveandnegativeselection,PNS）、标记基因的特异位点表达法及PCR法，其中用得最多的方法首推PNS法。其基本原理是：构建含有一段与靶基因同源序列（10～15kb）的载体，该序列的一个外显子插有neor基因作为正选择的标志，在此序列3’端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因作为负选择，HSV-tk基因由邻近的neor基因启动子调节。用电转移（electroporation）法将重组体导入ES细胞，继续作体外培养，并以新霉素（G418）和致死核苷类似物（GANC）作双重筛选。因随机插入的DNA通常以从头至尾整合入受体细胞DNA中，HSV-tk+基因产物可使GANC转变成一种有毒物质使细胞死亡。如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，neor基因在同源区之内得以保留，这样受体细胞抗G418有正选择作用，对GANC无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的（图23-3）。Plump等（1992）用基因剔除技术已培育出缺ApoE基因的TGM模型，并利用这一AS小鼠模型研究了饮食和遗传因素对AS的影响。图23-3正负双向选择法示意图a：同源重组；b：随机整合；neor：新霉素抗性基因；HSV-tkc：疱疹病毒胸苷激酶基因；GeneX：干细胞内源基因（与导入基因同源）；G418：新霉素；GANC：抗致死的核苷类似物GANC；GANC：核苷类似物参与合成，细胞致死。近几来，随着对基因失活方面研究的深入，引发了基因剔除技术的一大飞跃，产生了条件性基因剔除（conditionalgeneknockout）。条件性基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。目前多采用Cre-loxP重组系统（Cre-loxP-mediatedgenereplacement,Cre-loxPrecombinationsystem）。其中Cre重组酶来源于侵染大肠杆菌P1噬菌体。分子量38000，无论在大肠杆菌体内或体外，它都能启动DNA分子间或分子内的联合与重组，重组发生在一个被称为loxP的特异位点（loxpsite），且不需要其他的蛋白质因子。在Cre酶存在时，两个loxP位点可以同源重组，切除其中间的部分，留下一个loxP位点。其原理如图23-4所示。研究发现，在哺乳动物细胞中Cre重组酶也同样能引起DNA联合和位点特异性重组。图23-4Cre酶作用原理1Cre基因转译成Cre酶；2Cre酶作用于基因组上loxP位点；3Cre酶使两个loxP位点联合；4两个loxP位点发生同源重组切除X基因及一个loxP位点而仅留下一个loxP位点。Cu等（1994）在鼠的ES细胞中利用Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除的程序如下：①用常规性基因剔除方法将一段新构建的DNA序列整合至内源基因组，这段新构建的DNA序列由新的（突变的）基因片段，选择性标记基因HSV-tk及neor、一个将被取代的正常基因片段等几部分组成。在此新构建的NDA序列中，在可选择性标记基因和正常基因片段的两侧都连有loxP位点；②经过基因剔除的ES细胞被一个编码Cre重组酶载体迅速传染，因此处于两个loxP位点之间的HSV-tk、neor及正常的野生型基因均在Cre酶的作用下而被切除，只在原来的位置上留下了突变的基因和其3’端带有一个loxP位点，其Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除程序如图23-5所示。条件性基因剔除系统的建立，使得转基因的目的加明确，效果也进一步精确可靠，是基因剔除方法上的一个重大突破，将给动脉粥样硬化的研究增加更便利的条件。图23-5CreloxP重组系统进行条件性基因剔除程序1有待于被剔除的基因组上某野生型基因片段；2将一个loxP位点插在野生型基因片段的3’端；3将新构建的DNA序列整合到基因组上；4在Cre酶的作用下切除HSV-tk、neor野生型基因及一个loxP位点；5经过Cre-loxP重组系统作用后所形成的DNA序列。广义的转基因动物是指通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物。转基因动物可通过插入目的基因用于过表达基因研究，或是通过插入目的基因的shRNA来降低目的基因的本底表达，也可通过同源重组的方法获得基因Knock-in和Knock-out小鼠。小鼠作为最优秀的实验动物模型，在转基因动物研究领域也同样得到了广泛验证。转基因小鼠的制备技术主要有两类，DNA原核显微注射法和胚胎干细胞囊胚显微注射法。DNA原核显微注射法通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。此方法是最经典的用于制作转基因动物的方法，也是目前应用最广泛的方法，现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。由这种方法制备的动物品种属于狭义的转基因动物的范畴。由这种方法制备的转基因小鼠其插入目的基因的形式通常是多拷贝首尾相连的形式，其整合到基因组的具体机制目前并没有完全研究清楚。胚胎干细胞囊胚显微注射法是在体外将外源基因导入胚胎干细胞；然后将转基因的胚胎干细胞通过显微操作仪注入动物囊胚，此胚胎干细胞可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。胚胎干细胞体外培养时保持未分化状态，当被注入囊胚腔后，可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成，因此将外源DNA导入胚胎干细胞就可实现基因的转移。出生的动物其生殖系统就可能整合上外源基因，通过杂交繁育可得到具有纯合目的基因的个体，即转基因动物。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。基因的敲除及捕获常用这类方法。注：转基因小鼠制备技术路线，此图片由赛业（广州）生物科技有限公司提供显微操作技术（MicromanipulationTechnique）是指