仪器分析色谱法的基本原理

第二章色谱法的基本原理PrinciplesofChromatography本章基本要求⒈理解混合物中各组分在色谱柱内分离的原因；⒉了解色谱流出曲线和术语；⒊理解柱效率的物理意义及计算方法；⒋理解速率理论方程对实际分离的指导意义；⒌掌握分离度的计算方法及影响分离度的色谱参数。2.1概述2.1.1色谱法发展史色谱法是俄国植物学家Tswett（茨维特）于1903年首先提出的。他把植物色素的石油醚抽提液倒入一根装有固体碳酸钙颗粒（固定相）的竖直玻璃管（色谱柱）中，并再从管的上部加入纯的石油醚（流动相），任其自由流下。这时植物色素的抽提液沿玻璃管流动，在管内形成具有不同颜色的色带，每个色带代表不同的组分。--------“色谱”（色层）因而得名胡萝卜素（橙色）植物色素叶绿素（绿色）叶黄素（黄色）石油醚CaCO3固定相1941年，Martin、Syuge发明了液－液色谱。1952年，James、Martin发明了气相色谱。20世纪60年代，出现了高效液相色谱。⑴色谱法：借助在两相间分配系数的差异，而使混合物中各组分获得分离的技术称为色谱分离技术。⑵固定相：填充柱内的填料（固体或液体）。⑶流动相：携带样品流过固定相(气体、液体和超临界流体)。⑷色谱柱：装有固定相的柱。色谱分离过程：当流动相中携带混合物经过固定相时，与固定相发生作用，由于各组分的结构性质（溶解度、极性、蒸汽压和吸附能力等）不同，这种相互作用产生强弱的差异。在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，按先后不同的次序从固定相中流出。几个基本术语：气相色谱--------用气体作流动相液相色谱--------用液体作流动相由于固定相可分为固体吸附剂和涂在固体担体上或毛细管内壁上的液体固定相，故可将色谱法分为下述四类：气–固色谱气体固体流动相固定相液体液体1、按两相所处的状态分类液–液色谱2.1.2色谱法分类①柱色谱：固定相装在柱管内。它又可分为填充柱色谱和毛细管柱色谱。固定相装在色谱柱（玻璃管或毛细管）内。②纸色谱：用滤纸作固定相或载体，把试样液体滴在滤纸上，用溶剂将它展开，根据其在纸上有色斑点的位置与大小，进行鉴定与定量测定。③薄层色谱：将固定相研磨成粉末，再涂敷成薄膜。样品的分离形式类似纸色谱。2、按固定相形状分类①吸附色谱（L-S，G-S）：利用吸附剂对不同组分物理吸附性能的差异进行分离。②分配色谱（L-L，G-L）：利用不同组分在两相中分配系数的不同进行分离。在液-液分配色谱中，根据流动相和固定相相对极性不同，又分为正相分配色谱和反向分配色谱。③离子交换色谱（L-S）：利用组分离子与离子交换剂的交换能力不同进行分离。④空间排阻色谱（凝胶色谱法，L-S）：用多孔物质对不同大小分子的阻碍作用进行分离。固定相是一种分子筛或凝胶，利用各组分的分子体积大小不同而进行分离的方法。⑤亲和色谱：利用不同组分与固定相的高专属性亲合力进行分离的技术，常用于蛋白质的分离。3、按分离过程的物理化学原理分类色谱法的分类大致如下：根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中：2.2色谱分离原理2.2.1分配系数和分配比分配系数：分配比k（又称容量因子）定义：在一定的温度、压力下，组分在气–液两相间达平衡时，分配在液相中的重量与分配在气相中的重量之比。即msCCKs：固定相m：流动相KVVKVCVCnnmmkmsmmssmsmsk随柱温、柱压、相体积变化，由组分及固定液的热力学性质决定smVVβ：相比进样A＋B＋空气BAA+B流动相BBA流动相固定相检测和纪录2.2.2分离原理例：气相色谱法——载气（即流动相，是一种不与待测物作用、用来载送试样的惰性气体，如氮气等）载着待分离的试样通过色谱柱中的固定相，使试样在两相中发生反复多次的分配，最后使各组分分离，然后分别检测，记录各自的响应信号。2.3色谱流出曲线色谱流出曲线（色谱图）即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。峰高←色谱峰保留时间（分）1、有关术语①基线：柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图中O-t线。稳定的基线应该是一条水平直线。②峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，h③标准偏差④峰面积A⑤半峰宽Y1/2=2.354⑥峰底宽Y=4、Y1/2、Y：区域宽度死时间tm:不被固定相吸附或溶解的组分进入色谱柱时，从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间。对于气相色谱，常把空气(TCD)和甲烷(FID)从进样到出峰的时间称为tm。如图中O-A’。这种物质不被固定相吸附或溶解，其流速与流动相的流速接近。测定流动相平均线速度ū时可用柱长L与死时间tm的比值计算。mLutmLtu2、保留值保留时间tR试样从进样开始到柱后出现色谱峰极大值所需要时间。如图中O-B。它相应于样品到达检测器所需的时间。tR=tR′+tm调整保留时间tR′扣除死时间后的组份保留时间，即tR′=tRtm组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留的时间；tR′实际上是组分在固定相中滞留的时间。单位(s)或(cm)。死体积Vm不能被固定相滞留的（惰性）组分从进样到出现峰最大值时所消耗的流动相的体积。死体积可由死时间与流动相体积流速F0（L／min）计算：Vm=tm·F0保留体积VR从进样开始到柱后被测组份出现浓度最大值时所通过的流动相体积。如下：VR=tR·F022221111''RRR,''RRRtVttVt调整保留体积VR′某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积VR′=tR′·F0或VR′=VR-Vm相对保留值α2,1某组份2与组份1的调整保留值之比，是一个无因次量。α2,1的大小与两组分的选择性有关。α2,1越大，选择性越好，越容易分离。α2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关。因此是色谱法中，特别是气相色谱法中广泛使用的定性数据。从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：①根据色谱峰个数，可以判断样品中所含组份的最少个数。②根据色谱峰的保留值（或位置），可以进行定性分析。③根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。④色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。⑤色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。在自然科学上，科学理论：假设理论模型(数学表达式)实验验证修改模型完善1.塔板理论假设①在每块塔板上气液平衡是瞬间建立的。②载气以脉冲式(塞子式)进入色谱柱进行冲洗，每次恰好为一个塔板体积。③所有组分开始都加在第零号塔板上，且不考虑沿色谱柱方向的纵向扩散。④在所有塔板上同一组分的分配系数是常数，和组分的量无关。⑤柱分成几段，n为理论塔板数，每段高为H，柱长为L，n=L/H。2.4塔板理论假定：K=1Vs/Vm=1k=1n=5进样量w=10.50.50.250.250.250.250.1250.250.1250.12550.250.1250.06250.1880.1880.06250.06250.1880.1880.06250.031250.1250.1880.1250.031250.031250.1250.1880.1250.03125w=1μg1ΔV2ΔV3ΔV4ΔV①分布有一最大，两边逐渐减小②最大及整个分布曲线向后推移③流出曲线方程（塔板理论方程）在此检测得到位移随时间变化曲线这一理论得到结果：1．分布有一最大，两边逐渐减小；2．最大及整个分布曲线向后推移；3．流出曲线方程(也称塔板理论方程)，即数学表达式：2R2RR()22CeNVVNmVπVC：不同流出体积时的组分浓度m：进样量VR：保留体积N：塔板数V：流出体积SV(t,x)被测物流出色谱柱时流动相中被测物浓度随体积(或时间)的变化曲线：在气相色谱柱内，理论塔板数一般达103～106。塔板数越多，其流出曲线越接近于正态分布。根据塔板理论可以导出N与色谱峰半宽度或峰底宽度的关系：理论塔板高度H：LHN216RtNY色谱峰W越小，N越大，H越小，柱效能越高。因此，N和H是描述柱效能的指标。在实际工作中，计算出来的N和H值时,有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为用tR计算时，没有扣除死时间tm，应予扣除。所以用tR′代替tR计算出来的N值称为有效理论塔板数Neff。为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数Neff和有效塔板高度Heff。有效塔板数Neff和有效塔板高度Heff消除了死体积影响，较真实的反映了色谱柱的好坏。221255416RReff/.()()ttNYY有效塔板高度：根据tR′=tR-tm，k=tR′/tm，tR=tm(1+k)，可得effeffLHN2eff1kNN+k⒉塔板理论的成功与局限⑴成功①导出流出曲线数学表达式(模型)；②解释了流出曲线形状、浓度极大点；③提出了评价柱效的参数(N)及其计算公式。⑵局限①仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素；②不能说明影响柱效的原因及谱带扩张的原理；③不能说明流速对柱效的影响，实验测得流速不同时N和H不同。速率理论2.5速率理论1956年荷兰化学家VanDeemter等在研究气-液色谱时，讨论扩散传质等与色谱过程物料平衡和质量平衡的关系，考察溶质通过色谱体系总浓度的变化。他提出了色谱过程动力学理论—速率理论。随后Giddings吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，认为把色谱过程看作分子无规则运动的随机过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。VanDeemter方程的数学简化式为:BH=A++Cuu式中：u为流动相的线速度；A，B，C为常数A——涡流扩散项系数B——纵向分子扩散项系数C——传质阻力项系数（C＝Cs＋Cm)。其中Cs：固定相传质阻力项系数；Cm：流动相传质阻力项系数。A=2λdPλ填充不规则因子dP填充物颗粒的平均直径。影响A的因素：填充物颗粒大小dP和填充均匀性λ(取决于填充物颗粒的大小分布和装柱情况）有关,与载气性质、线速和组分无关。减小涡流扩散提高柱效的有效途径：使用适当的粒度且颗粒均匀的担体，并尽量填充均匀。AB涡流扩散项A分子扩散项B/uB=2Dg固定相填充在柱内后使气体扩散路径变弯曲的因素.Dg组分在气相中的扩散系数（cm2/s）。填充柱γ=0.5-0.7毛细管柱γ=1.0分子量大的组分Dg小，Dg反比于载气密度（分子量）的平方根,故采用分子量较大的载气可使B项降低。保留时间长,分子扩散项对色谱峰变宽的影响显著.Cgu--气相传质阻力项；Cg--气相传质阻力系数;Clu--液相传质阻力项；Cl--液相传质阻力系数传质阻力项CuCu=Cgu+Clu＝(Cg+Cl)u气相传质过程：气相传质阻力项与填充物粒度的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数成反比，因此采用粒度小的填充物和分子量小的气体作载气可提高柱效。液相传质过程：减小液膜厚度，增大组分在液相中的扩散系数，均可提高柱效。⒉速率理论的要点⑴被分离组分分子在色谱柱内运行的多路径、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气-液两相间分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。⑵通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。⑶速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导，阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。⑷各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响。因此，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。速率理论液相色谱法（P19）2.6分离度一、定义分离度是两色谱峰分离的程度。图中：a）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，表示选择性和柱效都很差。b）两峰距离拉开，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。c）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。tR（2），tR（1