农药登记毒理学试验方法(1)

中华人民共和国国家标准GB15670-1995农药登记毒理学试验方法ToxicologicaltestmethodsofPesticidesforregistration1主题内容与适用范围本标准规定了农药登记毒理学试验的方法、条件的基本要求。本标准适用于为农药登记而进行的毒理学试验。2急性经口毒性试验2．1目的求出试验农药对试验动物的半数致死剂量（LD50）；通过观察急性毒性效应的临床表现，初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机理；为亚慢性、慢性和其他毒性试验的剂量水平设计提供参考；为急性毒性分级和制定安全防护措施提供依据。2．2试验农药原药和制剂。2．3试验动物2．3．1主要选用品系、遗传背景明确的初年大鼠。各剂量组内同性别动物体重差异应小于平均体重的10%，组间同性别动物体重均值差异应小于5%。2．3．2每一剂量组的大鼠8~10只（雌雄各半），试验前要对动物观察一周，确认健康后，方可使用。2．4剂量分组2．4．1至少应设4~5个剂量组，各剂量组之间要有适当的剂量间距。以便各组出现不同程度的毒性效应（死亡率），求得剂量效应曲线及LD50。2．4．2如剂量达5000mg/kg体重以上，动物仍不出现死亡，则不需要进行更高剂量的试验。2．5给药方法及观察时间2．5．1动物给药前应隔夜禁食但不禁水，称重后，一次灌胃给药，给药后至少间隔2h进食。2．5．2灌胃量大鼠按100g体重给1mL，小鼠按20g体重给0.4mL计算，灌胃可用水溶液、油溶液或悬液。2．5．3给药后立即观察并记录动物的中毒表现，症状出现和消失的时间及死亡时间。给药当日应连续观察，其后，每日至少观察2次，观察期为14d。如在给药96h后出现迟发性新效应，则应延长观察期至3周或4周。2．6观察指标2．6．1中毒症状全面观察中毒的发生、发展过程和规律以及中毒特点和毒作用的靶器官。观察的系统包括：a．中枢神经系统和神经肌肉系统：体位异常、叫声异常、不安、呆滞、痉挛、抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝；b．植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪；c．呼吸系统：鼻孔流液、鼻翼煽动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰；d．泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀；e．皮肤和毛：皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽；f．眼：眼球突出、结膜充血、角膜混浊；g．消化系统：腹泄、厌食。2．6．2体重给药前、死亡时各称量一次体重，观察期间每3d称量一次。2．6．3一般不做病理组织学检查和生化指标检验，但对死亡动物应做大体病理学观察。如24h以上的存活动物，肉眼检查有病变时应做病理组织学检查。2．7结果评定2．7．1用统计方法计算LD50值。计算方法见附录A（补充件）。2．7．2按农药的急性经口毒性分级标准进行评定（见表1）。表1急性经口毒性分级标准级别经口LD50,mg/kg剧毒高毒中毒低毒55-5050-5005003急性经皮毒性试验3.1目的了解农药对试验动物皮肤直接接触引起局部皮肤损伤、全身中毒的特征等毒性效应，求出半数致死剂量（LD50），为制定农药生产和应用中的防护措施提供依据。3．2试验农药原药和制剂。3．3试验动物3．3．1为有足够的涂药面积，首选成年大鼠，体重要求200-300g。3．3．2各剂量组大鼠8~10只（雌雄各半）。3．4剂量分组3．4．1至少应设4个剂量组，各剂量组应有一定的间距，使给药组能出现毒性表现和死亡。3．4．2如果2000mg/kg剂量仍不出现死亡时，则不需要再进行高剂量试验。3．5给药方法及观察时间3．5．1给药前24h背部去毛，注意勿损伤皮肤，涂药面积应占体表面积10%，大鼠4×5cm^2，兔12×14cm^2，豚鼠7×10cm^2。3．5．2液体农药用原药液，粉末农药用水或溶剂稀释。3．5．3先将动物固定，在略小于剃毛面积内进行定量敷药，然后覆盖一个与脱毛面积相当的盒式罩，再用胶布固定。以防止动物舔食试验药品。3．5．4涂药持续时间为4h。3．5．5涂药4h后取下罩盒，用温水洗去皮肤上的试验农药，再进行局部观察。3．5．6观察时间为2周。3．6观察指标3．6．1中毒的临床表现，参照2.6.1。3．6．2死亡时间及死亡率。3．7结果评定3．7．1用统计方法计算LD50值。计算方法见附录A（补充件）。3．7．2按农药的急性经皮毒性分级标准进行评定（见表2）。表1急性经皮毒性分级标准级别经皮LD50(4h),mg/kg剧毒高毒中毒低毒2020-200200-200020004急性吸入毒性试验4．1目的测试可能经呼吸道进入机体的农药（尤其是挥发性强的农药）对呼吸道及全身的损伤及其危害程度。求出吸入接触的半数致死浓度（LC50），为农药的安全评价和制定生产应用中的防护措施提供依据。4．2试验农药原药和制剂。4．3试验动物4．3．1一种以上的哺乳动物，大鼠为首选动物。4．3．2动物性别、体重和每组动物数量的要求同2.3。4．4剂量分组4．4．1至少应设3个出现毒性效应直至死亡的剂量组。4．4．2如果以浓度2000mg/m3给药2h仍无死亡，则无需再做高浓度试验。4．5给药方法及观察时间4．5．1给药方式包括鼻、头部接触和全身置于染毒柜内接触两种方式。4．5．2染毒柜内应保持恒定的空气流量、农药浓度、温度及湿度，并要求柜内保持微负以免农药外漏。4．5．3吸入给药一般为2h。4．5．4给药后至少观察14d。4．6观察指标4．6．1中毒的临床表现，参照2.6.1。4．6．2死亡时间及死亡率。4．7结果评定4．7．1用统计方法计算LC50值。计算方法见附录A（补充件）。4．7．2按农药的急性吸入毒性分级标准进行评定（见表3）。表3急性吸入毒性分级标准级别LC50(2h),mg/m^3剧毒高毒中毒低毒2020-200200-200020005．急性皮肤刺激试验5．1目的测定农药对哺乳动物皮肤是否有刺激或腐蚀作用，估计人体接触该农药时可能出现的类似危害。5．2试验农药原药和制剂。5．3试验动物5．3．1兔或豚鼠，首选动物为白色家兔。5．3．2至少4只皮肤完好的健康动物。5．4剂量5．4．1一次涂药量为0.5mL或0.5g。5．4．2动物自身皮肤做为对照。5．5试验步骤5．5．1试验前24h将背部毛剪掉，面积约6cm^2。5．5．2涂上试验农药，再用纱布盖上，以胶布固定或采用其他封闭性盖罩，避免试验动物舔食。5．5．3涂敷持续时间一般为4h。时间结束时，用水或适当的溶剂洗去残留的农药，但注意不要操作皮肤。5．5．4根据需要做进一步的观察，以确定反应的可逆性。一般观察期不超过14d。5．6结果评定每一只动物试验结果按表4进行刺激反应评分，计算出平均分值，按表5进行强度评定。表4皮肤刺激反应评分症壮及程序积分A红斑形成0无红斑勉强可见明显红斑中等至严重红斑紫红色斑并有焦痂形成B水肿形成无水肿勉强可见水肿隆起轮廓清楚水肿隆起轮廓清楚水肿隆起约1mm水肿隆起超过1mm，范围扩大123401234总分A+B表5皮肤刺激强度分级强度分值无刺激性轻度刺激性中等刺激性强刺激性0-0.40.5-1.92.0-5.96.0-8.0注：pH≤2或pH≥11.5的农药可不进行本试验6眼刺激试验6．1目的了解试验农药对眼睛的刺激作用和程度，为农药生产和使用中的安全防护提供依据。6．2试验农药原药和制剂，但对具有强酸、强碱性质的化合物（pH≤2,pH≥11.5）不需做此试验。6．3试验动物成年的白色家兔至少4只。试验前24h检查试验家兔双眼，有异常者不得使用。6．4剂量液体农药或100倍稀释液0.1mL,粒状农药不超过100mg，且应先将颗粒磨成细粉。6．5给药方法及观察时间6．5．1将一侧下眼睑轻轻下拉，把试验农药滴入结膜囊内，为防止药液外溢，立即轻轻闭合眼睑约1min。如果用喷雾给药法，将眼睑分开，在眼前方10cm距离处迅速喷雾1s。6．5．2给药后24h内不洗眼。6．5．3对侧眼为对照。6．5．4给药后于1，24，48，72h分别检查眼睛。如72h仍无刺激反应时，则终止试验。6．5．5如果出现角膜操作或眼睛其他部位出现反应，要继续观察损伤的经过及其可逆性，观察期最长不超过21d。6．5．672h刺激反应仍不消退时，至少另选4只家兔观察洗眼效果。即滴入药物后分别在4s和30s时用生理盐水洗眼5min，观察洗眼后的眼睛反应情况。6．6观察指标除了观察结膜、角膜、虹膜外，还应注意其他部位的损害。6．7结果评定按表6将每只动物的角膜、虹膜和结膜的刺激反应的分值相加，即是一只动物眼刺激反应的总积分。每个动物的刺激反应积分的总和除以动物数，就是该试验农药对眼刺激性的最后分值。再按表7评定眼刺激程度。表6眼损伤程度评分部位及程度积分角膜A混浊（以最致密部位为准）无混浊散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见01续表6部位及程度积分半透明区易分辩，虹膜模糊不清出现灰白半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认B角膜受损范围1/41/4-1/21/2-3/43/4-12341234最高积分80(积分AXBX5)虹膜正常邹折明显加深，充血，肿胀，角膜周围有轻度充血，瞳孔对光仍有反应出血，肉眼可见破坏，对光无反应（或出现其中之一反应）012最高积分10（积分x5)结膜A充血状态（系指睑结膜、球结膜部位的血管）血管正常充血012血管充血呈鲜红色血管充血呈深红色，血管不易分辨弥漫性充血呈紫红色B水肿无轻微水肿（包括瞬膜）明显水肿，伴有部分眼睑外翻水肿至眼睑近半闭合C分泌物无少量分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着分泌物使整个眼区潮湿或粘着3012340123最高积分20[A+B+C)X2]角膜、虹膜、结膜反应累加最高积分110(80+10+20)表7眼刺激性分级刺激强度眼刺激积分指数(I.A.O.I)眼刺激的平均指数(M.I.O.I)无刺激性轻度刺激性0-55-1548h048h5轻度至中度刺激性中度刺激性中度至重度刺激性重度刺激性15-3030-6060-8080-1104d57d207d407皮肤变态反应（致敏）试验7．1目的测试动物在反复接触农药后，机体产生免疫传递的皮肤反应的可能性，从而确定农药的变态反应性（致敏）。7．2试验农药制剂。7．3试验动物豚鼠、每组动物数10~20只。7．4剂量致敏（诱导）浓度允许引起皮肤轻度刺激反应（即最高耐受浓度）。激发浓度一般低于致敏浓度，不得引起原发刺激性炎症反应。7．5试验步骤7．5．1接触致敏的发病过程包括致敏和激发两个阶段。a．致敏接触实验前24h将动物背部左侧去毛3cm×3cm。将试验农药0.1~0.2ml涂在2cm×2cm滤纸上，并将其敷贴在去毛区，用两层纱布，一层油纸或不透水塑料膜覆盖，再以无刺激胶布封闭固定，持续6h。第7d和第14d以同样方法重复一次。b．激发接触实验前24h将动物背部右侧去毛2cm×2cm。末次致敏后14~28d，将0.1~0.2mL或低于诱导浓度的试验农药斑贴于右侧去毛区，覆盖方法同7.5.1a.持续6h，去掉斑贴及试验农药后，每日观察至第12d。如无致变，可再次激发以确定试验农药能否引起过敏反应。7．5．2试验须设阳性或阴性对照组，阴性对照组仅给予激发接触。7．6结果评定将出现皮肤红斑或水肿（不论程度轻重）的动物数除以动物总数，求出动物致敏率，再按表8进行致敏率强度评定。表8致敏率强度分级致敏率分级强度分类0-89-28ⅠⅡ弱致敏物轻度致敏物续表8致敏率分级强度分类29-6465-8081-100ⅢⅣⅤ中度致敏物强度致敏物极强度致敏物8亚急性经口毒性试验8．1目的通过经口途径在1~4周的时期内，连续多次给予不同剂量的试验农药，观察因试验农药的蓄积作用所产生的不良反应，确定亚急性无作用剂量和靶器官，并为亚慢性或慢性毒性试验的剂量设定提供依据。8．2试验农药原药。8．3试验动物8．3．1首选大鼠。作为长期试验的预试验时，两种试验应使用同一种属和品系的动物。8．3．2选用大鼠的年龄一般为6~8周，体重变异应不大于平均体重的10%。8．3．3每剂量组至少10只动物，雌雄各半。若试验过程中需要提前剖杀