放射免疫技术

第七章放射免疫技术第一节放射免疫技术一、原理及分类二、常用的放射性核素三、标记物制备及鉴定四、抗血清鉴定第二节放射免疫分析一、基本原理二、实验方法及测定第三节免疫放射分析一、基本原理二、IRMA与RIA的比较思考题小结免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。标记免疫技术－基本概念常见标记免疫技术放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术第一节放射免疫技术早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA其它一、放射免疫技术－原理及分类二、放射免疫技术－常用的放射性核素125I3H射线γβ理化性活泼差核素丰度90%－半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂常用标记核素125碘-标记物的制备－标记125I-化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应直接标记法三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体积200μl反应时间1-2分钟弱碱性反应条件间接标记法联接标记(bolton-Hunter)预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。bolton-Hunter125碘-标记物的制备－纯化凝胶过滤法离子交换层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱法聚合、损伤物标记蛋白游离125I125碘-标记物的制备－鉴定标记物质量高比放射性高纯度完整免疫活性放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95%免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大,标记物免疫活性好比放射单位化学量标记物中所含的放射性强度单位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性过高，将影响标记物免疫活性计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.自身置换法：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性结果准，测定复杂比放射性－计算法结果欠准，计算简便自身置换曲线反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少两条曲线平行,若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性标准曲线反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准抗原组成标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少比放射性－自身置换法标准曲线与自身置换曲线平行表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合的抗原物质总量相同计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算为nCi/ml)计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量(ng/ml)以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng)四、放射免疫技术－抗血清鉴定抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度用亲和常数Ka表示。单位为稀度单位（LM-1）Ka值高（109～12L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度亲和性亲合力高亲合力低放射免疫技术－抗血清鉴定特异性:指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力交叉反应率：将反应的最大结合率抑制下降50%时特异性抗原与类似物的剂量（ED50）之比抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性特异性效价五、方法学评价除了常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性之外，应注意以下指标：可靠性剂量-反应曲线高剂量钩状效应第二节放射免疫分析一、放射免疫分析－基本原理竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(B＋F)与Ag的量变存在着函数关系－剂量反应曲线注：T即是B与F的总和二、放射免疫分析－实验方法及测定抗原抗体反应Ag*Ag反应条件体积温度时间pHAb(标准Ag/样品Ag)平衡非平衡一步法二步法分离结合、游离标记物二抗体沉淀法PEG沉淀法PR试剂法活性炭吸附法分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响操作应简单、重复性好经济测量、数据处理晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm)计算参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)拟合注：T即是B与F的总和第三节免疫放射分析一、免疫放射分析－基本原理以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。单位点IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合未结合标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量双位点IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。二、IRMA与RIA比较RIAIRMA标记物抗原抗体原理竞争性结合非竞争结合反应体系Ag*、Ag、Ab固相Ab、Ab*、Ag反应动力学慢快灵敏度相对低高检测范围窄宽1~2数量级特异性差（PcAb）优（McAb）标准曲线结合率与测值成反比结合率与测值成正比待测抗原大小分子二抗原决定簇放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。放射免疫分析技术的应用1.放射免疫技术的核心是什么？2.制备放射性125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？3.评价125I标记物质量的指标有哪些？4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？5.放免分析中标记/未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物的量变关系？6.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？7.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？8.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？9.γ闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？10.灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有何区别？思考题放射免疫技术的基本原理是放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合，主要包括RIA和IRMA。RIA所用的标记物应具备高比活度、高纯度和完整的免疫活性；抗血清应具有较高的抗体亲和力、高度的特异性和适宜的工作滴度；标准品浓度需按标准进行标定；结合与游离反应物的分离（二抗法、PEG法、PR试剂法和固相法）应彻底、迅速、不影响反应平衡、非特异性低和操作简便。拟合标准曲线需根据不同检测项目和不同的要求选用恰当的反应参数。小结