分子生物学技术在中药机理研究中的作用

作者：范秀娟，郭姣，杨国柱，罗朵生【摘要】在文献检索的基础上，对近10年来在中药作用机理中主要应用的分子生物学技术——核酸分子杂交技术、反转录-聚合酶链式反应技术、差异显示PCR技术和DNA阵列技术的基本原理、应用实例、优势与不足做了概述，并对未来的中药机理研究技术、方向和前景做了展望。中国论文联盟【关键词】分子生物学技术；中药；作用机理中药自古以来就是我国人民防治疾病的主要武器，对中华民族的生存与繁衍起着不可忽视的作用，长期的医疗实践累积了宝贵而丰富的经验，并与中医学共同形成了一套完整独特的理论体系。但如何用现代科学技术语言阐释其作用机理，提供科学依据，使其广为世界接受是一重大难题。近年来，分子生物学技术的发展，不仅根本性地改变了生命科学的研究方式，也为中药的作用机理研究提供了有力工具和良好的发展契机，使得中药基因转录水平的机理研究成为可能。笔者对近10年来有关分子生物学技术在中药基因转录水平作用机理研究中的应用综述如下。1核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是分子生物学的基本技术之一，基本原理是具有一定同源性的2条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针。其中将核酸提取分离后在体外与探针杂交的是印迹杂交，直接在组织细胞内进行的是原位杂交。中药作用机理研究中较早常用的有RNA印迹杂交(Northernblot),点杂交（dotblot）和原位杂交。二仙汤是治疗妇女更年期综合征、抗衰老的名方，具温补肾阳、泻相火、调冲任功能。廖柏松等［1］采用Northernblot对18月龄雌性大鼠下丘脑内阿片肽的基因表达水平进行研究，结果表明，二仙汤组β内啡肽前体阿黑皮素原和脑啡肽原的mRNA水平明显升高，达到未衰老前水平。沈小珩等［2］则从衰老过程抗氧化酶活性降低，且酶活性降低与其蛋白质基因表达水平降低平行的现象出发，采用分子杂交等技术考察二仙汤及其拆方对超氧化物歧化酶、过氧化氢酶基因表达水平及其活性的影响。结果表明，抗氧化酶活性显著升高，且与其mRNA表达水平升高呈平行关系,提示二仙汤抗衰老是通过增强抗氧化酶基因表达水平而实现的。海风藤有祛风除湿、通经活络的功效。韩恩吉等［3］采用Northernblot观察它对人类神经母细胞瘤细胞系列淀粉样前体蛋白(βamyloidprecursorprotein,βAPP)基因表达的抑制作用。结果发现，海风藤选择性地抑制βAPP基因表达,为其防治阿尔茨海默病提供了一定依据。郑钦岳等［4］应用dotblot研究了补血和血方四物汤对白细胞介素6（interleukin6，IL6）mRNA表达的影响，实验表明,四物汤在0.01～1.00ng/mＬ浓度内可使IL6mRNA的表达明显增加。保心丸具有降脂、降低血浆内皮素、抑制血小板聚集等作用。为进一步阐明保心丸抗实验性动脉粥样硬化（artherosclerosis，AS）的机理,樊永平等［5］用原位杂交技术研究内皮素（endothelin，ET）和一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase,NOS)在AS家兔主动脉壁的基因表达。结果证实，保心丸组ET1mRNA的表达较模型组低,而NOSmRNA较模型组高,提示保心丸调节血管内源性NO和ET之间的平衡可能是其抗实验性AS的机理之一。精制血府胶囊是血府逐瘀汤的化裁精简方，其抗心肌缺血疗效明显优于原方，为揭示其作用机制，证实其疗效，王伟等［6，7］分别采用Northernblot和原位杂交等技术，研究其对于心肌缺血密切相关基因表达的影响，前者结果表明精制血府胶囊显著提高缺血缺糖心肌细胞NOSmRNA表达水平，后者的精制血府胶囊组，ET1和内皮素转换酶（endothelinconvertingenzyme，ECE）1的mRNA表达较其它组明显减少，且心肌细胞损伤也较其它组显著减轻。因而推测精制血府胶囊可能是通过提高NOS表达、促进NO生成及抑制ET1、ECE1的基因表达，减少ET1生成，减轻其对心肌细胞的直接损伤，发挥保护心肌细胞的作用。Northernblot是用来测量真核生物RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法，并可从大量RNA样本中同时获得这些信息，但需要大量的材料，受RNA降解影响大，敏感性低。dotblot的不足之处在于点于同一张膜上同样的样品杂交信号有时不稳定，且一般要用纯化的RNA样品。原位杂交的优势在于可对组织细胞中的核酸进行精确定位。核酸分子杂交是分子生物学基本技术，随着反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RTPCR）技术、差异显示PCR（differentialdisplayPCR，DDPCR）、DNA阵列等优势技术的出现、逐渐成熟而应用渐增，近5年应用基本的分子杂交技术研究中药作用机理的报道已少见。2RTPCR技术PCR是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，RTPCR是从RNA扩增cDNA拷贝的方法，即先将RNA反转录成cDNA，再用PCR扩增，使其敏感性大大提高，解决了dotblot或Northernblot中目的mRNA含量太低的问题，是目前中药机理研究中最常用的分子生物学技术，从发表的文献数量可以反映出来。这方面的研究报道包括有Gumiganghwaltang(GMGHT)抗炎机制的研究，KIMSJ等［8］研究其在小鼠腹膜巨噬细胞中的抗炎机制，结果显示，GMGHT以剂量依赖的方式降低了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactoralpha，TNFα）,IL6和环氧酶2mRNA表达水平，推测这是GMGHT减少炎症的重要分子机制之一。为了阐释二仙汤治疗肾阳虚证的作用机理，郑小伟等［9］考察了二仙汤不同时间对肾阳虚大鼠垂体促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophichormone，ACTH)基因表达的影响。结果是二仙汤可以上调垂体组织ACTH基因表达，且表达量随用药时间延长而增加，提示上调ACTHmRNA表达是二仙汤治疗肾阳虚证的作用机理之一。β地中海贫血是一种遗传性溶血性贫血病，补肾生血方具有补肾、益髓、生血作用，用于治疗杂合子患者疗效明显。为揭示其分子机理，吴志奎等［10］采用RTPCR等技术考察了用药者的α、β和γ珠蛋白mRNA转录水平。结果发现，补肾生血胶囊能明显提高β地中海贫血患者血红蛋白（hemoglobin，Hb）和抗碱血红蛋白（hemoglobinF），Hb珠蛋白链比增加，γ珠蛋白mRNA转录水平相应升高，说明补肾生血药具有促进γ珠蛋白转录和表达，诱导HbF合成作用，代偿了β珠蛋白基因的缺陷。益髓生血颗粒是补肾生血方的颗粒剂，易杰等［11］研究了其对β地中海贫血患者造血刺激因子干细胞因子（Stemcellfactor，SCF）及人红细胞生成素受体（erythropoietinreceptor，EPOR）mRNA表达的影响。结果显示，治疗后,外周血EPOR、SCFmRNA表达明显增强，因此推测益髓生血颗粒可能是通过影响SCF以及EPORmBNA表达来促进骨髓造血,提高Hb、红细胞的水平,达到治疗β地中海贫血的目的。陈智松等［12-14］从此方的抗衰老及中医肾生髓理论的角度出发，分别研究其对骨髓有核细胞中诱导细胞凋亡、促使机体衰老的原癌基因cmyc、抑制细胞凋亡的原癌基因Bcl2和造血刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimutaingfactor，GMCSF)基因表达的影响。结果表明，衰老时高表达的骨髓cmyc，明显降低的Bcl2和GMCSF，用药后，前者表达水平明显下降甚至不表达，后两者表达明显提高。因此认为补肾生血方通过抑制cmyc的表达，促进Bcl2表达，从而抑制骨髓细胞凋亡，延长细胞寿命，延缓了衰老，并结合有关的医学成果，认为Bcl2和GMCSF是肾生髓的本质相关基因。凌云彪等［15］研究清热活血补益方(肝纤方)对大鼠肝脏Ⅰ型前胶原mRNA的表达和胶原酶活性的影响。结果表明,以清热活血补益方制备的含药血清抑制了Ⅰ型前胶原mRNA的表达，胶原酶的活性增加。提示此方抑制Ⅰ型前胶原mRNA的表达,减少胶原的合成,同时提高胶原酶的活性促进胶原的降解,可能是其抗肝纤维化的部分机制。此外，蔡晶等［16］通过检测雌激素受体(estrogenreceptor，ER)α和βmRNA表达量，考察了补肾阳中药淫羊藿和补肾阴中药女贞子对雄性大鼠杏仁核和皮质顶叶ERmRNA的调节表达差异,结果显示，两用药组大鼠杏仁核、皮质顶叶ERαmRNA表达量无明显变化,ERβmRNA表达量都上调，且淫羊藿组高于女贞子组，说明补肾中药可能是通过对ERβ的调节来发挥作用。