现代生物技术大实验指导书

《生物技术大实验》实验指导书生物技术教学部常平安舒坤贤谢永芳编重庆邮电学院生物信息学院2005年3月1日1前言《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国内外最新的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件，特选择了部分实验内容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。由于分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。编者2005年3月2目录实验一质粒的提取和纯化…………………………………………….3实验二质粒DNA的电泳和纯度检测…………….……………………..6实验三PCR产物的TA克隆……………………………………………...9实验四感受态大肠杆菌细胞的制备…………………………………...12实验五重组DNA转化大肠杆菌…………………………………........12实验六PCR扩增基因特异片段………………………………………..15实验七DNA片段的回收及纯化………………………………………..19实验八PCR法快速鉴定重组载体……………………………………...22实验九限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒…………………………...24实验十外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测……………………….28实验十一RNA的提取及其纯度检测……………………………………32实验十二逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段…………………..35实验十三DNA探针制备……………………………………………..…38实验十四Southern印迹杂交……………………………………………41实验十五Northern印迹杂交……………………………………………44实验十六荧光原位杂交（FISH）技术…………………………………47实验十七外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测…………………...50实验十八生物芯片技术………………………………………………...53实验十九RNAi技术……………………………………………………56实验二十蛋白质组技术………………………………………………...58附录基因工程基本技术路线…………………………………………….603实验一质粒的提取和纯化实验目的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8)只吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链)等。本实验选做的是碱法。1.裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有TritonX-100等。2．分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。3．纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰RnaseA分解除去。蛋白质可通过酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿／异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿（(1:1)）一氯仿（或氯仿／异戊醇24:1)，处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（氯仿／异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。实验内容：试剂1.LB培养液(1L)细菌培养用蛋白胨10g细菌培养用酵母粉5g4NaCl10g用10mol／LNaOH调至pH7.0，高压蒸气灭菌,4℃贮存.2．溶液Ⅰ，可成批配置，灭菌后4℃贮存。葡萄糖50mmol／LTris-C1(pH8.0)25mmol／LEDTA10mmol／L3．溶液Ⅱ(新鲜配制)NaOH0.2mol／LSDS1％4．溶液Ⅲ5mol／LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制好的溶液Ⅲ含3mol／L钾盐，5mol／L醋酸(pH4.8)卡那霉素(Kana):50mg/ml,过滤除菌.5．重蒸酚市售苯酚蒸馏纯化(收集179～181℃之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上，4℃保存。6．氯仿异戊醇(24:1)7．无水乙醇8．RNaseA(10mg／ml)9．3mol／LNaAc(pH5.2)10．TE10mmol／LTris-C1(pH8.0)1mmoI／LEDTA材料含有质粒(pNTE-EGFP,pEGFPN3)的大肠杆菌DH5a.操作步骤1．挑取琼脂培养板上的含有pNTE-EGFP,pEGFPN3质粒的单菌落，接种至5mlLB培养液(含Kana50μg／m1)，37℃振荡培养过夜。2．取出1.5ml培养液至1.5ml离心管中，12000r／min离心2min，弃上清。3．将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液工中，强烈振荡混匀。4．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖，轻轻颠倒混匀5次，冰浴5min。5．加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10s，冰浴5min。6．12000r／min室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5m1Eppendorf管中。7．加入等体积酚／氯仿(1:1)，振荡混匀，12000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。【注意】酚具有腐蚀性，操作时小心。8．加人等体积氯仿，振荡混匀，12000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。10．加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃沉淀10min。11．12000r／min离心10min，去上清，沉淀用70％乙醇洗涤一次，空气中晾干。12．加入20μlTE溶解质粒DNA，加入RNaseA，终浓度20μg／m137℃水浴0.5h。513经0.7％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后观察抽提结果。【注意】EB为致癌物，操作时一定要戴乳胶或一次性手套。14．将该管质粒保存于-20℃备用。注意事项1．该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净，获得一定得率的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要，也较困难，因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂解成小片段，从而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，加入SDS后，则要注意不能过分用力振荡，温和混匀,但又必须让它反应充分。加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理!2.加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出.2．加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒翻摇动4～5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA。3．乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出)。否则，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不完全。4．为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带，加入1μlRNA酶，将管置50℃水浴箱内30min，消化RNA。6．抽提产物经电泳分离、EB染色后，在紫外线灯下可观察到三个条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒DNA。【思考题】碱法提取质粒的原理是什么？【课外阅读】高纯度质粒DNA的提取,参阅Qiagen公司说明书,网站:的电泳和纯度检测实验目的：掌握DNA琼脂糖电泳技术，了解紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理。实验原理：带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。其中，凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法。与蛋白质分子类似，核酸分子也是两性解离分子。在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。所以采用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。值得注意的是，等长度的单链DNA和双链DNA在中性或碱性凝胶中的迁移率大致相等。1．影响泳动的四大因素(1)影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质：包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。一般来说颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒物理形状愈大，与支持物介质摩擦力越大，泳动速度越小。即泳动率与颗粒的分子大小，介质粘度成反比；与颗粒所带电荷成正比。在检测未知DNA分子量时，DNA分子的空间构型不同，即使相同的分子量其迁移率也不同。如质粒DNA存在闭环(Ⅰ型，CC)，