现代生物技术实验讲义

现代生物技术实验讲义DNA重组技术与基因检测芯片技术动物细胞培养及细胞活性检测技术发酵工程及分离提取技术华东师范大学生命科学学院SCHOOLOFLIFESCIENCES,EASTCHINANORMALUNIVERSITY2007年9月1引言随着生物技术的发展，生物工程的专业技术人员的需求更为迫切，特别是生物技术已经渗透到各个行业，并已蓬勃发展。生物技术的发展不但要有深厚的理论基础，而且要求专业技术人员具有较强的动手能力，因为该学科是一门实践性较强的科学。在培养生物技术专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等课程实验。这些实验为培养学生的基础操作能力、提高学生的实际动手能力等奠定了良好的基础，但是这些实验都是单个的小实验，各个实验各自为一体，没有系统地相互关联，学生完成实验后没有一个完整的概念。本实验以基因工程、细胞工程和发酵工程实验为基础，组成了生物工程中上游、中游和下游技术。其中每一个部分放弃了原来单独小实验的结构，而改为一个独立的大实验，增加了学生的设计性和主动性。这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容，又注意到相互联系。本讲义分为三个部分，第一部分“DNA重组技术与基因检测芯片技术”；第二部分“动物细胞培养及细胞活性检测技术”；第三部分“发酵工程及分离提取技术”。这些实验采取大实验方法，使学生有一个完整的操作过程，对理解生物工程的上游、中游和下游技术有了感性认识。2第一部分DNA重组技术与基因检测芯片技术黄静陆泉枝编目录前言………………………………………………………………………………………………31.相关基础知识……………………………………………………………………………….…..41.1DNA重组技术的基本原理………………...…………………………………………………41.2基因芯片技术的基本原理…………………………………………………………………...62.实验目的和要求…………………………………………………………………………….…72.1DNA重组技术实验目的和要求………………………………………………………….......72.2基因芯片技术实验目的和要求……………………………………………………………...73.实验材料和仪器…………………………………………………………………………….…83.1实验材料………………………………………………………………………………….…83.2主要仪器设备…………………………………………………………………………….…83.3实验器皿……………………………………………………………………………………...83.4细菌培养基…………………………………………………………………………………...83.5分子生物学试剂……………………………………………………………………………...83.6SDS-PAGE电泳试剂…………………………………………………………………………93.7基因芯片试剂……………………………………………………………………………….104.实验内容………………………………………………………………………….……………104.1DNA重组技术实验内容………………………………………………………….………..104.2基因芯片技术实验内容………………………………………………………………….....115.习题………………………………………………………………………………………….…126.参考资源…………………………………………………………………………………….…126.1参考书目………………………………………………………………………………………126.2参考产品目录………………………………………………………………………………...136.3参考网站……………………………………………………………………………………...13附录一质粒DNA的提取………………………………………………………………………14附录二琼脂糖凝胶电泳…………………………………………………………….………….15附录三DNA的纯度、浓度的测定…………………………………………………………….17附录四DNA的酶切和连接（体外重组）…………………………………………………….18附录五大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化………………………………19附录六重组转化子DNA的鉴定（篮白斑筛选法）…………………………………………21附录七重组转化子DNA的鉴定（限制性内切酶分析法）…………………………………22附录八DNA的体外扩增（PCR技术）………………………………………………………23附录九SDS－PAGE电泳………………………………………………………………………25附录十毛囊中DNA的提取……………………………………………………………………28附录十一基因型检测芯片检测ACE基因多态性………………………………………………283前言二十一世纪是生物学的世纪，分子生物学作为生物学最前沿的基础学科是生物学类专业通向生物高技术的必修课程。随着人们在分子生物学水平上的研究和学习的深入和广泛展开，除了在分子水平上了解生物学的本质特征外，在分子水平如何进行生物学操作是生物学界共同关心并十分重视的问题。“DNA重组技术”就是利用分子生物学的一般原理阐述在分子生物学实验中所涉及的技术方法、原理和策略，是一门指导分子生物学实验操作的理论与实践相结合的课程。随着生物科学和生物技术的日益发展，人们越来越重视对生物学研究手段的了解和掌握。作为新世纪的生命科学学院的大学本科生有必要学习DNA重组技术的原理和方法，学会和掌握DNA重组技术。本实验讲义就是为基因工程操作的入门者而编写的。基因工程技术的核心内容就是DNA重组技术，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要生产出不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。根据这一定义，基因工程技术涉及到极其广泛的生物学新技术新方法，但它又有一个基本的操作程序。因而，我们按照DNA重组技术的操作程序来安排实验，即从载体的选择→目的基因的制备→体外DNA的重组（酶切与连接）→重组DNA分子引入受体细胞→转化子的筛选→重组DNA分子的鉴定等步骤编排成一个综合性大实验。在这个综合性实验中，每一步实验既相对独立又与下一步实验紧密相连，只有获得第一个步骤的实验结果才能开始第二个实验。因此，实验也涵盖了所要训练的单项技术。在实验取材方面，我们以大肠杆菌为基本资料，建立适合于大肠杆菌的DNA重组技术实验。我们旨在通过这些实验，让同学们获得分子生物学最基本的技术训练，掌握最基本、最常用的技术，并对DNA重组技术有一个比较全面而系统的概念。此外，生物芯片技术已被国际公认为是正在和将要给二十一世纪的生物科学、医药、农业、环保等领域带来革命性变化的新技术，作为新世纪生物技术专业的大学生，有必要接触生物芯片的一些基本知识。鉴于目前实验条件有限，本实验教程的内容仅涉及一种基因（ACE基因）的多态性检测，让同学们了解基因检测芯片技术的一般原理和操作技术，为今后的工作和学习打下基础。作者2006.941.相关基础知识1.1DNA重组技术的基本原理基因工程技术的核心内容就是DNA重组技术，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要生产出不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是DNA重组技术的重要特征。另一个特征是繁殖。重组DNA技术主要包括以下几个要素：载体；工具酶；外源DNA，即要克隆或表达的DNA片断；原核或真核宿主细胞。基因克隆的基本步骤是先用限制性内切酶切割外源DNA和载体（质粒DNA载体或噬菌体载体），然后连接酶连接，组成DNA重组分子（重组质粒，见图1），转化入受体细胞，构建出基因文库，再筛选。除了通常的克隆外，还有亚克隆。初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。图1重组质粒构建示意图载体的作用是把外源DNA带进宿主细胞，并使之在细胞内建立稳定的遗传状态，在细胞内繁殖、传代或进行表达。质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。常见的质粒载体有：pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如：pBluescriptⅡKS（±）。大肠杆菌表达载体是最常见的原核表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A和纤维素结合位点等。重组DNA所涉及的工具酶，最主要的是II型限制性内切酶和DNA连接酶。Ⅱ型限制性内切酶用来切割DNA，相当于基因工程中的“剪刀”。II型限制性内切酶识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+的存在才能发挥活性。识别序列主要为4bp～6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异。如EcoRI5和HindⅢ的识别序列和切割位置如下。EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTTCTTAA↑GTTCGA↑A连接酶则是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。常用的T4DNA连接酶是在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离的，需Mg2+和ATP的存在才能发挥活性。它能催化两条匹配DNA链的3’－OH和5’－P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。外源DNA就是需要克隆的DNA片断，一般有四种来源。（1）限制性内切酶切割DNA产生的片断，经电泳分离后回收获得；（2）大DNA分子经人工剪切产生的片断，这种片断一般是平末端；（3）cDNA，即与mRNA互补的DNA，由真核基因的mRNA逆转录制备；（4）人工合成的基因，例如根据蛋白质的氨基酸顺序和遗传密码合成的一些基因。外源DNA分子与载体（质粒）经过相同的酶切可以产生相互匹配的粘末端或平末端，经DNA连接酶连接就构成了重组DNA分子（重组质粒）。质粒的转化就是指将质粒或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌（受体细胞）的过程。这一步是实现重组克隆的增殖。受体细胞要接纳外源DNA，必须处于感受态。所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而使外源DNA能进入细胞，一般转化率为109～1010转化子/μgDNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化率约106～107转化子/μgDNA。获得转化子后可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。首先可根据转化细胞的特征进行初步筛选。由于载体都具有供筛选用的遗传标记，如抗生素，细胞转化后获得了这种遗传特性，使用含适当的相应抗生素的培养基即可初步筛选出转化的细菌。经过培养初步筛选出来的细菌不一定都含有重组DNA，还需进