利用合成生物学生产药物和燃料

第23卷第9期2011年9月Vol.23,No.9Sep.,2011生命科学ChineseBulletinofLifeSciences文章编号：1004-0374(2011)09-0875-07利用合成生物学生产药物和燃料王　猛，赵惠民*(DepartmentofChemicalandBiomolecularEngineering,UniversityofIllinoisatUrbana-Champaign,Urbana,IL61801,USA)摘　要：合成生物学是一个快速发展的研究领域，其重要性体现在科学研究和应用开发两方面。它不但加深了我们对复杂的生物过程与机理的理解，而且使得基础生物研究向实际应用的快速转化成为可能。将介绍一些新型高效的合成生物学工具以及如何利用它们开发能从可再生原料生产药物和燃料的工程菌株。关键词：合成生物学;生物燃料;代谢工程;蛋白质工程;基因调控中图分类号：O621.33;Q816文献标志码：AMicrobialsynthesisofdrugsandfuelsviasyntheticbiologyWANGMeng,ZHAOHui-Min*(DepartmentofChemicalandBiomolecularEngineering,UniversityofIllinoisatUrbana-Champaign,Urbana,IL61801,USA)Abstract:Syntheticbiologyisarapidlygrowingresearchfieldofscientificandpracticalimportance.Itnotonlydeepensourunderstandingofcomplexbiologicalprocessesandmechanismsbutalsoenablestherapidtranslationoffundamentalbiologicalresearchtopracticalapplications.Inthisreview,wewilldescribeafewnovelandhighlyefficientsyntheticbiologytoolsandtheirapplicationsinthedevelopmentofrecombinantorganismscapableofproducingdrugsandfuelsfromrenewablefeedstock.Keywords:syntheticbiology;biofuel;metabolicengineering;proteinengineering;generegulation收稿日期：2011-03-28基金项目：NationalInstitutesofHealth(GM077596)*通信作者：E-mail:[e-mail]随着能源危机的爆发和自然环境的持续恶化，以石油为基础的药物和燃料生产工业越来越受到石油供给和价格的影响，所以寻找可再生能源以代替石油成为药物和燃料生产原料的需求日益紧迫[1]。尽管有机合成有了很大的发展并被广泛地应用于工业中，微生物合成仍然是生产很多小分子化合物的更有效方法。这些小分子化合物涵盖了从简单的生物燃料到复杂的天然产物和药物。相比于有机合成，微生物合成拥有众多的优点：第一，酶能够一步催化很多复杂的化学反应，而这些反应往往需要很多步有机化学反应才能完成。第二，由多个酶组合而成的代谢途径能免去中间产物的纯化步骤。而这些纯化步骤都是有机合成所不可避免的。昀后，微生物合成往往可以使用葡萄糖等便宜的原料，从而使得生产过程有利于环境保护。传统上，微生物合成的设计、组建和优化的过程被定义为代谢工程(metabolicengineering)。随着微生物合成在各个层面都变得越来越复杂，例如有更多的基因需要被加入到代谢途径中，同时，越来越多的多基因调控需要被考虑到，代谢工程慢慢进化为一个更宽泛和先进的领域——合成生物学(syntheticbiology)[2-3]。合成生物学更关注于系统化的设计和组建新的生物元件。例如酶、遗传线路(geneticcircuits)、代谢途径和细胞(图1)。在这篇综述中，我们将介绍一些新型高效的合成生物学工具以及它们在药物和生物燃料的微生物合成领域的广泛应用。1　合成生物学工具1.1　蛋白质工程工具蛋白质或者酶是合成生物学中昀简单，也是昀生命科学第23卷876重要的生物元件，特别是在药物和生物燃料的微生物合成领域。考虑到经济效益和工业应用，酶需要满足更高的要求，如更高的催化效率和更高的稳定性。然而，自然界中天然存在的酶通常不能满足这样的要求。合成生物学工作者已开发一系列的工具用于寻找或创造这样的酶[4]。其中定向进化(directedevolution)就是一个非常重要和有效的工具。在药物和生物燃料微生物合成领域，定向进化的目标往往是使酶能更有效而稳定地催化某一步化学反应。首先，通过易错聚合酶链(式)反应(errorpronePCR)等突变方法产生目标基因的随机库，在特定的宿主中表达后通过使用高通量筛选(highthroughputscreening)或选择方法(selection)，挑选得到具有更高目标性能的突变基因。然后，经过多轮的突变和筛选过程，有利突变得以积累和叠加，昀终得到具有昀好的目标特性的变异基因[5]。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)是一类能够催化β-糖苷键水解的酶。这类酶往往对β-糖苷类化合物具有混杂活性(promiscuousactivity)。它们在制造生物燃料[6]及一些其他工业过程中有很重要的应用。例如β-葡萄糖苷酶能水解纤维素二糖(cellobiose)为葡萄糖，而后者则能被发酵为包括乙醇在内的生物燃料。同时通过降低纤维素二糖的反馈抑制，β-葡萄糖苷酶也被应用于提高纤维素降解效率。Hardiman等[7]用定向进化中RNDM(randomdriftmutagenesis)的方法产生了β-葡萄糖苷酶突变库。通过荧光激活细胞筛选(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)方法，他们得到了一系列对不同β-糖苷类底物具有更高催化活性的β-葡萄糖苷酶。虽然定向进化是一个对于提高酶的特定性能非常有效的工具，但是作为定向进化模板的这种天然酶往往首先需要具有非常类似的活性。而另一方面，全新设计(denovodesign)一种能催化特定化学反应的酶是很困难，但也非常有价值的工作[8]，特别是在某些化学反应在自然界中还没有发现有酶能够催化的情况下，蛋白质全新设计这一工具更有无法比拟的先进性。例如，在自然界中还没有发现能催化4-hydroxy-4-(6-methoxy-2-naphthyl)-2-butanone的逆醇醛缩合(Retro-aldol)反应的酶。基于赖氨酸催化形成schiff碱或亚胺中间体的化学机理，Jiang等[9]通过计算机设计出了大量这类酶的蓝本。经过RosettaMatch算法优化后，他们选择了一共72种蛋白质设计方案并进行实验验证。这些设计基于10种不同蛋白质骨架，而每种设计有8至10个不同的氨基酸。结果基于不同蛋白质骨架的一共32种蛋白表现出了逆醇醛缩合反应活性。同时，通过图1适用于微生物合成药物和燃料的合成生物学工具适用于微生物合成药物和燃料的合成生物学工具王　猛，等：利用合成生物学生产药物和燃料第9期877X射线衍射确定那些活性蛋白的结构几乎和设计一模一样。这说明该全新设计方法的准确性和实用性很高[9]。综上所述，定向进化和蛋白质全新设计各有互补的优缺点。定向进化的优势在于不需要大量关于模板蛋白的结构和功能的知识就能针对已有特定性能进行快速的改进；而全新设计方法的优势在于创造能催化全新化学反应的酶。合理地同时运用这两种工具能发挥出更好的效果。例如，Rothlisberger等[10]首先通过蛋白质全新设计得到了一系列能催化Kemp消除反应的酶。这类酶具有6~160M-1S-1等不同的Kcat/Km值。之后对这些蛋白质通过几轮定向进化的优化，一些突变蛋白的Kcat/Km值提高了200倍以上。1.2　代谢途径工程工具药物及生物燃料的微生物合成往往需要经过一系列酶催化的多步化学反应来实现。即使每一步反应都已经拥有良好的备选酶，如何将它们组合成高效的代谢途径，特别是如何平衡蛋白表达与活性以实现目标产物的产量昀大化是非常大的挑战。与传统的分子生物学和细胞生物学相比，合成生物学更适合于代谢途径的组建与优化。合成生物学首先将不同的生物元件组建成合适的代谢途径，然后通过在不同层面(转录和翻译等)对代谢途径中不同基因的表达进行调控与优化，从而达到目标产物产量昀大化的目的。在原核生物中，因为基因表达的调控大部分通过转录水平的调控来完成，启动子(promoter)在代谢途径的调控中能起到非常重要的作用。诱导型启动子(induciblepromoter)是一类被广泛应用于基因表达调控的生物元件。通过加入小分子诱导物，诱导型启动子能在合适的时候启动代谢途径中基因的表达，以达到目标产物的产量昀大化。除了研究和使用昀广泛的乳糖(lactose)和阿拉伯糖(arabinose)诱导型启动子[11]，另有一些新的诱导型启动子被发现及应用，如Lee和Keasling[12]在Salmonellaenterica中研究出了一套以丙酸为诱导物的可诱导表达系统，得到了比广泛使用的T7启动子更好的基因调控效果。除了小分子诱导物，光也能被用于诱导基因表达。Lindberg等[13]利用光敏性psbA2启动子控制异戊二烯合成酶的表达，成功达到了由光强度控制异戊二烯合成量。在低价值化合物或药物的微生物合成过程中，使用昂贵的诱导物不利于提高经济效益。这时组成型启动子(constitutivepromoter)就比诱导型启动子更加实用，而且定向进化方法能被应用于产生一系列具有不同强度的组成型启动子以达到对代谢途径的精确调控与优化[14-15]。Alper等[16]应用荧光激活细胞筛选方法(FACS)对噬菌体组成型PL-λ启动子的突变库进行筛选，昀终得到22个具有不同强度的突变启动子。为了评估这个启动子库的实际使用效果，他们使用这些启动子对脱氧木酮糖磷酸合成酶(deoxy-xylulose-Psynthase,DXS)的表达进行精确控制,昀终提高了番茄红素(lycopene)的产量。在原核生物中，除了启动子以外，控制核糖体结合位点(ribosomebindingsites)的强度是另一种重要的控制蛋白表达量的方法。Salis等[17]开发出核糖体结合位点强度的预测算法，这使得人为地通过调节核糖体结合位点强度对蛋白表达量进行精确控制成为可能。通过在大肠杆菌中测试超过100个核糖体结合位点的强度，他们发现预测结果和实验结果相当吻合。随着合成生物学的不断发展，同时对多个基因进行精确调控的要求变得越来越普遍。使用不同的可诱导启动子对不同基因进行调控的方法已经被证明是可行的[18]，但是可诱导启动子的数量限制和不同诱导物之间的干扰作用极大的限制了这一方法的广泛使用。另一种选择是使用定向进化的方法得到一系列能响应同一诱导物的具有不同强度的诱导型启动子[19]，但同样的这种优化过的启动子库更加稀少。此外，不基于启动子的工具也能被用于多个基因的调控[20-21]，如Alper和Stephanopoulos[22]开发了gTME(globaltranscriptionmachineryengineering)用于不同基因的同步调控。在概念型实验中，Globaltranscriptionmachinery(特指σ70)先通过随机突变然后被转入大肠杆菌中。三种不同的表型：乙醇耐受性、代谢产物过量生产、多重表型被作为筛选目标。结果显示gTME方法比传统方法能更快更好地对表型进行优化和提高。当然，生物对基因调控的方式不仅限于转录水平。得益于近年来高速发展的关于mRNA结构和调控的研究，合成生物学发展出通过不同mRNA