10Chap19色谱分析的基本原理

第19章色谱法的基本原理CommonConceptsandPrinciplesofChromatography§11.1概述(Overview)Introduction一、色谱法的由来OriginofChromatography1903,Russianbotanist,M.S.TswettCaCO3petroleumetherSample:PlantpigmentsChromat(o)+graph(y)Chromatography现在分析的大多是无色物质，保留了色谱法的名字But,uptill1930sthemethodofTswettfinallyreceivedrecognition,andbecameanimportanttoolinbothorganicchemistryandbiochemistrylaboratories.分离原理：当流动相中所含混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用。由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小强弱也有差异，因此，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，按先后不同的次序从固定相中流出。固定相：固体吸附剂、液体（涂在惰性固体担体上或附着于毛细管内壁）流动相：气体、液体二.色谱法分类气相色谱法液相色谱法(一)按两相所处的状态分类气固色谱法液固色谱法气液色谱法液液色谱法（二）按固定相的几何形式分类3.薄层色谱法柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。2.纸色谱法1.柱色谱法（三）按分离原理分类1.吸附色谱法2.分配色谱法3.离子交换色谱法4.尺寸排阻色谱法5.亲和色谱法按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为：SeeP349表19-119-2色谱法的流出曲线及有关术语ChromatogramandItscorrespondingterms分配系数(PartitionCoefficient)KsmCKC所以，一般在低浓度时，K为常数，因此，色谱法注入少量样品组分流出顺序：K越大，流出越慢流出曲线及有关术语如图：Ｐ34919–1典型的分配等温线若Ｋ为常数，则分配等温线为线性，如图中直线ＣＡ、Ｂ、Ｄ都非线性，但在低浓度时，Ａ、Ｂ、Ｄ也为线性线性洗脱：指在洗脱过程中分配系数为常数色谱过程色谱图流出曲线KAKB固定相：固体吸附剂：分离原理：吸附→解吸→吸附→解吸液体：分离原理：溶解→挥发→溶解→挥发1.基线当色谱柱没有组分进入检测器时，反映检测器系统噪声随时间变化的线称为基线。稳定的基线是一条直线。基线漂移：指基线随时间定向的缓慢变化。基线噪声：指各种噪声所引起的基线起伏（波动）。2.保留值保留值是用来表示试样中各组分在色谱柱中滞留时间的数值。通常用时间或用组分流出色谱柱所需流动相的体积来表示。死时间tM指不与固定相作用的物质（如空气，甲烷）从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间。死体积VM指色谱柱在填充后柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相可以忽略不计时死体积可由死时间与色谱柱出口的载气体积流速F0(mL·min-1)来计算。VM=tM·F0保留时间tR指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间。调整保留时间tR´指被扣除死时间后的保留时间。tR׳=tR–tM相对保留值r2,1或指某组分2的调整保留值与另一组分1的调整保留值之比：,,(2)(2)2,1,,(1)(1)RRRRtVrtV(2)2,1(1)RRtrtr2,1亦可以用来表示固定相（色谱柱）的选择性。r21值离1越远，两组分的tR´相差也越大，分离也越好。r21=1时，两组分不能被分离。r亦可用来表示。与r的区别：永远大于1，称选择性因子(2)2,1(1)RRVrV保留体积VR指从进样开始到柱后被测组分出现浓度最大值时所通过的载气体积VR=tR·F0调整保留体积VR´指被扣除死体积后的保留体积。即；VR´=tR´·F0VR´=VR-VMhh1/2YY1/20.607h区域宽度色谱峰区域宽度是色谱流出曲线中的一个重要参数。从色谱分离的角度看，希望区域宽度越窄越好。标准偏差0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半半峰宽度Y1/2二分之一峰高处对应的峰宽度，它与标准偏差的关系为1/222ln22.354Y峰底宽度Y自色谱峰侧的转折点所作切线在基线上的截距。它与标准差的关系为Y=4ó利用流出的曲线（色谱图）可以解决以下问题：（1）根据色谱的位置（保留值）可以进行定性检定（2）根据色谱的面积或峰高可以进行定量测定（3）根据色谱峰的位置及其宽度，可以对色谱柱分离情况进行评价。§19-3色谱法基本理论在气相色谱分析的流程中，多组分的试样的分离是通过色谱柱而得到的，那么这是怎样实现的呢？色谱柱有两种：一种是内装固定相的，称为填充柱，通常为用金属（铜或不锈钢）或玻璃制成的内径2-6mm/长0.5~10m的U形或螺旋形的管子。另一种是将固定液均匀的涂敷在毛细管的内壁上，形成中空的柱子，称为毛细管柱。在填充柱内填充的固定相有两类即气-固色谱分析中的固定相和气液色谱中的固定相。气-固色谱：固定相：吸附颗粒，具有多孔型及较大面积。吸附脱附气液色谱：固定相是在化学惰性的固体颗粒表面，涂上一层高沸点的有机化合物，这种高沸点的化合物称为固定液。溶解挥发SMcKc组分在固定相中的浓度组分在流动相中浓度分配系数分离原理：不同组分在两相间具有不同的分配系数在实际工作中常应用另一表征色谱分配过程的参数—分配比。分配比亦称容量因子或容量比，是指在一定温度、压力下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相间的质量比，用k来表示：smnkn组分在固定相中物质的量组分在流动相中物质的量()()xSsSxmmMcVVkKKcVVVS/VM为相比。P35119-6P35219-11说明：对于一给定的色谱体系，组分的分离最终决定于组分在每相中的相对量，而不是相对浓度，因此分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数。分配比与保留时间的关系根据物质的量与保留时间成正比'RMRMMtttkttP35219-10一.塔板理论对于一个色谱柱，评价其好坏，可以从流出曲线解释，研究流出曲线，需从热力学角度来讨论。1952年，Martin等人提出了塔板理论，解释了流出曲线的形状以及板高等概念，从而根据板高评价色谱柱的好坏，他由此获诺贝尔奖基本假设：设想色谱柱为一个精馏塔，分为一段一段，每段称为一个塔板，流动相带着试样流经色谱柱，进入一个塔板，分配达平衡，然后再进入下一个塔板，每次一个板体积12225.54()16()RRttnYY设柱长为L，理论塔板高度为H，则理论塔板数n=L/H从流出曲线可得理论塔板数计算经验式：从公式可知，n越大，若出峰时间一定，则峰越窄，表明柱效能越高因此，理论塔板数反映了柱的效能。实际工作中常出现这样的情况，计算出的n虽然很大，但分离效果并不理想，原因：死时间不参与柱内的分配，所以提出了有效塔板数的概念：2'2')(16)(54.521YtYtnRR有效有效有效nLH1.色谱峰越窄，塔板数n越多，理论塔板高度H就越小，此时柱效能越高，因此n和H可一作为描述柱效能的一个指标。2.n有效和H有效能较为真实地描述柱效能的好坏。*同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的。说明：例：已知两组分A.B.流出峰WA=40sWB=50stR(A)=400stR(B)=600s计算平均塔板数n解：nA=16（tR/W）2=16(400/40)2=1600块nB=16（tR/W）2=16(600/50)2=2304块对不同物质，分离是不一样的，所以计算n时，必须指明哪中物质1952块塔板理论在解释流出曲线的形状（呈正态分布），浓度极大点的位置及计算和评价柱效等方面都取得了很大的成功。速率理论但它在某些方面的基本假设是不合理的：纵向扩散忽略分配系数与浓度无关两相分配达到平衡塔板高度和塔板数受那些因数的影响不同的流速下测得不同的理论塔板数不能很好的解释1956年荷兰学者范弟姆特(VanDeemter)等人从动力学角度考虑，在研究气－液色谱时，提出了色谱过程的动力学理论-速率理论。该理论吸收了塔板理论的有益成果－－塔板高度的概念，抛弃了塔板理论的不合理假设，主要考虑分子扩散，传质阻力和载气流速等因素对柱效的影响，所以可以较好地解释影响板高的因素。二.速率理论BHACuu1、范弟姆特方程式P35719-25ABACuuACuA、B、C：常数，每项都有一定意义，如图：流速小于最佳流速，第二项起主导作用，流速大于最佳流速，第三项起主导作用，在最佳流速处，H最低uu最佳H实际操作，比最佳流速高一些2、范氏方程各项意义（1）涡流扩散项A常数A称为涡流扩散(EddyDiffusion)，当流动相碰到填充物颗粒时，不断的改变流动方向，使试样组分在流动相中形成类似“涡流”的流动，因而引起色谱峰的扩张。A=2dP填充物的平均颗粒直径对于空心毛细管柱A等于0。不规则因子降低A项方法：用颗粒均匀的固定相，用细颗粒固定相，但颗粒太细，流动相不易通过，柱前需要压力大。通常根据实际需要选择颗粒大小。（二）分子扩散项－－纵项扩散试样组分被带入色谱柱后，是以塞子的形式存在与色谱柱的很小一段空间中，在塞子的前后存在着浓差而形成浓度梯度，因此使运动着的分子，发生纵向扩散。B=2Dg－－组分在流动相中的扩散系数：路径弯曲因子，与填充物有关，（固定相颗粒存在，阻碍纵向扩散）空心毛细管柱=1，填充柱：：0.5—0.7降低B项方法：用分子量大的载气（Dg小），降低柱温（扩散慢）增大流速，减少保留时间，阻碍被测物扩散载气带着试样流经色谱柱，一部分进入固定相，扩散到内部，达平衡又出来，被载气带走，影响这一过程的阻力称传质阻力。有的试样没到固定相内部即被带走，所以有的在固定相时间长，有的短，使色谱峰变宽。（三）传质阻力项C传质：由于浓度不均匀而发生的物质迁移C=Cg+Cl2220.01(1)pgdkCgkD固定相平均直径，为降低C，要求小些好组分在气相扩散系数，要求大些好。采用氢气，扩散系数大2223(1)flldkCkD固定液厚度，要求薄些好组分在液相中的扩散系数降低Cg方法：颗粒小的固定相，小分子流动相降低Cl方法：降低固定液厚度考虑各项因素，得范氏方程2222220.0122()(1)3(1)gpfpglDddkkHduukDkD由上述方程可解释许多实验条件对板高的影响P35719-24例：考虑A项，用颗粒均匀的固定相，用细颗粒固定相考虑B项：用分子量大的载气（Dg小），降低柱温（扩散慢）增大流速考虑C项：固定相平均直径小些好，用分子量小的载气（Dg大），降低固定液厚度，减小流速1307在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效提高，可选用：（１）适当提高柱温（２）增加固定液含量（３）增大颗粒直径（４）增加柱长（四）最佳流速和最小塔板高度根据H=A+B/+C若使H为最小，则对流速微分2/dHBCd/BC最佳/2//ABBCCCHACBB最小若已知常数ABC，则可求最佳和H最小根据塔板理论可求有效搭板数，板高等，n有效越多，分离效果越好，但若两峰相近，需多少n有效才能分开呢？塔板和速率理论都无能为力所以引入一个新的概念----分离度§19－4分离度(Resolution,R)色谱分离的两种情况ttSS如何评价？(2)(1)(2)(1)12122()1()()2RRRRttttRYYYY两组