MHC相合造血干细胞移植后cGVHD小鼠模型建立

MHC相合造血干细胞移植后cGVHD小鼠模型建立李海霞1,王婵2,吴秉毅3,张传仓2(审校),封志纯2(1.北京军区总医院附属八一儿童医院山西医科大学在读硕士研究生;2.北京军区总医院附属八一儿童医院;3.南方医科大学附属珠江医院,指导老师)摘要:目的建立主要组织相容性复合物(MHC)相合造血干细胞移植的慢性移植物抗宿主病(Chronicgraftversehostdisease,cGVHD)小鼠模型,为进一步研究cGVHD的发病机制及防治方法构建平台。方法以雄性DBA/2H-2d为供鼠,雌性BABL/CH-2d为受鼠,接受60Co515Gy全身照射后分成3组,4~6h内完成移植。A组输注RPMI1640培养液、B组输注5@107个脾细胞/只、C组输注10@107个脾细胞/只。（脾细胞移植作用？）观察指标为:¹造血重建时间;º移植物植入情况;»各组小鼠cGVHD的临床表现;¼各组的病理学改变及成模率。结果¹造血重建:C组较A、B组造血重建延迟,差异有统计学意义。º植入情况检测:移植组小鼠均为供、受者共存的混合嵌合体。»cGVHD的临床表现及评分:A组均未出现cGVHD的临床表现,B、C组小鼠出现cGVHD的临床表现,两组的临床评分有统计学差异(P=01016)。¼病理改变及成模率:A组病理学未见明显异常;B、C两组出现cGVHD的病理学改变,但是两组评分无统计学差异(P=01410);根据病理学评分判断各组小鼠的成模率分别为0%、60%、80%。结论60Co515Gy全身照射后输注5@107个脾细胞可诱导出cGVHD小鼠模型,且配型方式与临床MHC相合造血干细胞移植类似,可以作为研究MHC相合造血干细胞移植后cGVHD的理想模型。关键词:MHC相合;慢性移植物抗宿主病(cGVHD);小鼠模型中图分类号:R-33文献标识码:A文章编号:1006-9534(2010)07-0026-05异基因造血干细胞移植是目前根治恶性血液系统疾病,以及某些遗传性疾病、免疫缺陷病、实体瘤的最有效方法之一。但是慢移植物抗宿主病(cGVHD)是异基因造血干细胞移植最主要的并发症和导致移植失败及患者死亡的重要原因之一,严重影响了异基因造血干细胞移植治疗的疗效。近年来,尽管移植方式不断改进和新的免疫抑制剂的不断研发,cGVHD仍未得到理想的控制,究其原因是对cGVHD的发病机制了解甚少。因而,建立接近人类cGVHD病理机制及临床表现的动物模型,对cGVHD的研究具有重要意义。本实验受鼠减低剂量预处理后,输注MHC相合、次要组织相容性抗原(mHiAs)不相合的供鼠脾细胞,诱导出类似人类cGVHD表现的小鼠模型,为进一步研究cGVHD的发病机制及防治途径提供平台。（背景）材料与方法1.实验动物:供鼠为雄性DBA/2H-2d小鼠,受鼠为雌性BALB/CH-2d小鼠,均为8-12周,SPF级,由北京市维通利华动物实验公司提供。饲养于北京大学医学部动物实验中心SPF级动物房内,给予无菌食物、高压消毒无菌水、辐照消毒垫料。2.主要试剂及仪器:RPMI1640(无血清)溶液,苔盼蓝染液,秋水仙素,固定液(甲醇B冰醋酸=3B1),倒置显微镜,超净工作台,血细胞计数板,200目不锈钢筛网,低温高速离心机,60Co放疗机(由军事医学科学院辐照研究所提供)。3.实验方法:(1)受鼠预处理、分组:受鼠BABL/CH-2d移植前5d开始饮用含庆大霉素(320mg/L)和红霉素(250mg/L)的饮用水,直至移植后2周。移植当天采用60CoC射线全身照射进行预处理,照射剂量为5.5Gy（抑制免疫）。预处理后采用随机字表法分通讯作者:封志纯组,如下:A组单纯照射组(n=10,经尾静脉输注0.5mlRP-MI1640培养液),B组(n=10,经尾静脉输注5@107个脾细胞),C组(n=10,经尾静脉输注10@107个脾细胞)。各组于照射后4~6h内完成移植。(2)供鼠脾细胞制备:将DBA/2供鼠颈椎脱臼处死,无菌条件下解剖取脾,置200目筛网研磨、过滤,制成单细胞悬液,用红细胞裂解液裂解红细胞后,调节细胞浓度为10@107/ml、20@107/ml备用。(3)外周血染色体制备:小鼠腹腔注射秋水仙素3~4Lg/g,5h后以眼球摘除法,留取0.5~1ml全血(加肝素抗凝),0.075mol/LKCl溶液低渗处理,反复3次固定后滴片,Giemsa染色10min,室温晾干后镜检。4.观察指标(1)造血重建观察:于-1、7、14、21、28天分别检测受鼠外周血白细胞情况,监测造血功能重建时间;(2)移植物植入检测:实验终点B、C组各选取2只小鼠制备外周血单个核细胞染色体标本,计数20个分裂相,检测Y染色体的阳性率。(3)cGVHD的临床评分:脾细胞移植后每天观察小鼠一般状态,包括体重、被毛、姿势等,移植14天后每3天进行一次临床评分,评分标准参照国内外相关文献[1-5]的进行评分,部分内容根据本实验略作修改。评分标准见表1[5]。表1慢性GVHD的临床评分标准得分0分1分2分3分脱毛无1cm21~2cm22cm2体重减轻无或减轻[2%2%~8%\8%弓背体态无不影响运动影响运动注:(l)耳朵、尾巴、脚掌每处脱皮或结痂记0.3分,皮肤临床表现最低得0分,最高得3.9分。(2)皮肤得分超过0.6分视为发生GVHD;即使症状消退、小鼠自然死亡或人为因素造成死亡也视为发生GVHD;小鼠无症状死亡视为无GVHD。#26#中国优生与遗传杂志2010年第18卷第7期(4)慢性移植物抗宿主病的病理评分:濒死小鼠或实验终点颈椎脱位处死小鼠,解剖,取皮肤(肩胛部或病变部位)、肝脏、小肠、肾脏等器官,经10%福尔马林固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色等制备病理切片,镜下观察并评分。评分标准见表2。表2慢性GVHD的病理评分标准[1,5]得分0分1分2分3分4分皮肤表皮正常轻度增生明显增生真皮正常轻度改变伴少量胶原沉积大量胶原沉积炎症无局灶性浸润广泛浸润皮下脂肪正常脂肪细胞减少严重萎缩毛囊(个/mm)51~51肠道炎症无轻度中度重度无溃疡重度有溃疡肝脏正常或30%门管区炎性细胞浸润30%~40%门管区炎性细胞浸润40%~60%门管区炎性细胞浸润60%~80%门管区炎性细胞浸润伴淋巴细胞浸润胆管100%门管区炎性细胞浸润伴胆管细胞死亡或裂解注:(l)得分超过2视为发生GVHD。5.统计学方法:采用SPSS16.0分析软件,实验数据用Mean?SD或中位数表示,连续变量比较采用t检验或F检验,其它比较采用非参数检验;患病率用Kaplan-Meier法生存曲线表示,并用log-rank检验,以A=0.05作为显著性差异的检验水准。结果1.造血重建（？因为自身恢复还是脾细胞移植所致？）时间观察移植后1周内白细胞下降明显,（照射导致的免疫抑制？）第7天各组外周血白细胞下降到最低点,A组小鼠照射后7~10天时血象开始回升（？因为脾细胞移植？Or机体自身修复？）,移植组(B、C组)血象回升相对缓慢（因为GVHD？）。28天时C组与A组,C组与B组比较差异有统计学意义(P值分别为:0.005,0.013)。表3小鼠白细胞变化图如下:(@109/L)组别-1d7d14d21d28dA组7.08?1.3770.72?0.3702.20?0.4143.48?0.8075.84?0.983B组7.11?1.6660.99?0.2852.15?0.7503.25?0.8485.60?0.867C组7.42?1.8041.02?0.3651.86?0.4062.99?0.7284.50?0.832F值0.1342.1551.0290.8385.648P0.8750.1360.3720.4440.010说明:移植当天为0d,移植前一天为-1d。2.染色体检测实验终点B、C组各选2只小鼠检查外周血细胞y染色体阳性率分别为:5/20、5/20和8/20、7/20,结果非清髓预处理后形成混合嵌合体。染色体图附后,见图1。图1移植后小鼠染色体核型(XY)3.慢性移植物抗宿主病的临床症状观察及评分(1)一般症状观察:移植后1周内3组小鼠表现基本相似,表现为体重进行性下降,伴有皱毛、精神萎靡、活动减少、弓背等症状,均未观察到腹泻症状,移植后1~3天,体重下降明显,平均每天下降约1g左右,1周后体重开始上升,活动增加。随后各组小鼠的表现如下:A组小鼠体重逐渐上升,未再出现体重下降、皱毛、弓背等GVHD表现,其中有1只小鼠在照射后第3天死亡,另一只于照射后第8天意外死亡,其余小鼠均存活至实验终点。B、C组小鼠随后出现第2次体重下降,但是下降程度较第1次减轻,并维持一段时间。体重下降的中位时间分别为30.5天、27.5天,C组体重下降中位时间较B组提前,但是B、C两组体重下降的中位时间无统计学差异(P=0.192)。B组小鼠均存活至实验终点,C组小鼠分别在移植后25天、32天各死亡1只,其余5只死亡时间集中在65~75天左右,实验终点共存活3只小鼠。(2)临床评分结果:B、C组小鼠临床表现评分见表4,A组小鼠未出现cGVHD表现,Wilcoxon秩和检验对B、C两组临床评分进行比较,差别具有统计学意义(P=0.016),且C组临床评分高于B组。#27#中国优生与遗传杂志2010年第18卷第7期表4慢性GVHD的临床评分编号B组C组124205304.3423534624.37308039301004MeanRank7.413.6P0.0164.慢性移植物抗宿主病的病理评分及患病率(1)病理评分结果小鼠濒临死亡或实验终点处死后行病理学检查,根据病理变化判断是否发生cGVHD。cGVHD皮肤病理改变为:表皮略增厚,皮下脂肪减少,胶原沉积等;肝脏表现为肝细胞肿胀,汇管区炎性细胞浸润,胆管细胞坏死等;小肠病变为肠绒毛结构扭曲、变钝、肠粘膜下层有大量淋巴细胞浸润,程序性凋亡;肾脏病变为肾小球硬化、灶性坏死,部分肾小球有血管增生性改变等(病理图见图2、3、4)。A组病理改变未见明显异常,B、C均出现不同程度的cGVHD改变。病理学评分见表5。Wilcoxon秩和检验B、C两组病理学改变评分无统计学意义(P=0.410)。图2表皮细胞轻度增生@400图3肝脏汇管区淋巴细胞浸润@400图4小肠淋巴细胞浸润@200图5患病率生存曲线表5慢性GVHD病理评分编号B组C组1562143124225536267418129211012MeanRank9.4511.55P0.410(2)患病率根据各组小鼠的病理学改变判断3组的成模率分别为0%、60%、80%。成模率低考虑与供、受鼠之间MHC匹配有关。结合临床评分及病理评分对各组的GVHD患病率进行分析,log-rank检验对各组的患病率的Kaplan生存曲线差别有统计学意义(P=0.001),B、C两组患病率无统计学差异(V2=3.369,P=0.066)。B、C两组的患病率用Kaplan-Meier法生存曲线表示(患病率曲线见图5)。讨论慢性移植物抗宿主病(cGVHD)是异基因造血干细胞移植患者后期的主要并发症,异基因造血干细胞移植100天后约20%-70%的病人发生慢性移植物抗宿主病[6-9]。随着#28#中国优生与遗传杂志2010年第18卷第7期移植模式的转化,如外周血干细胞移植、减低剂量预处理移植、无关供者、HLA不相合移植及供者淋巴细胞输注的应用,cGVHD的发病率有上升趋势[10]。对cGVHD的发病机理及防治在不断研究中,而且取得了进步,但由于cGVHD受累器官的多样性、疾病的慢性病程以及血液学和免疫学的功能异常,其发生率及死亡率并没有改变。建立更为接近临床的cGVHD动物模型,有利于更准确发现cGVHD的发病机制及有效的防治方法。目前cGVHD的动物模型相对少,国外多选用亲代y子一代MHC半相合移植和MHC相合(mHiAs不相合)移植建立cGVHD模型,国内多采用前者,对MHC相合的cGVHD的小鼠模型国内报道相对少。动物模型的选择要根据不同的研究内容及研究目的而定。在人类,MHC不匹配移植确