超临界流体色谱法

超临界流体色谱法1超临界流体色谱法的概述2超临界流体色谱法的特点3超临界流体色谱法的工作原理4超临界流体色谱仪5超临界流体色谱法的应用超临界流体色谱法的概述超临界流体色谱(supercricalfluidchromatography,SFC)是以超临界流体作为流动相的色谱方法，是20世纪80年代以来发展迅速的一个色谱分支。超临界流体：在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。它既不是气体，也不是液体，它的物理特性介于气体和液体之间。三相点：在热力学里，可使一种物质三相（气相，液相，固相）共存的一个温度和压强的数值。如：水的三相点在0.0076℃及610.75Pa；汞的三相点在−38.8344℃及0.2MPa超临界流体色谱法的概述纯物质的相图如图所示，在温度高于某一数值时，任何大的压力均不能使该纯物质由气相转化为液相，此时的温度即被称之为临界温度(Tc)；而在临界温度下，气体能被液化的最低压力称为临界压力(Pc)。当物质所处的温度高于临界温度，压力大于临界压力时，该物质处于超临界状态。温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体。超临界流体色谱法的概述从热力学上看，超临界流体的密度是气体的100-1000倍，和液体相近，具有和液体相似的溶解能力及与溶质的作用力。从动力学上看，超临界流体的黏度比液体低，可以使用比液相色谱更大的线速度；扩散系数是液体的10-100倍，传质速率高，因而可以获得比高效液相色谱更高的柱效和更快的分析速度。超临界流体色谱法的特点SFC因其超临界流体自身的一些特性，使得该方法较气相(GC)和液相(LC)有一定的优势1.SFC与GC的比较SFC可以用比GC更低的温度，从而实现对热不稳定化合物进行有效的分离。由于柱温降低，分离选择性改进，可以分离手性化合物。由于超临界流体的扩散系数比气体小，因此SFC的谱带展宽比GC的要窄。SFC溶剂能力强，许多非挥发性组分在SFC中溶解度较大，可分析非挥发性的高分子、生物大分子等样品。选择性较强，SFC可选用压力程序、温度程序，并可选用不同的流动相或者改性剂，因此操作条件的选择范围较GC更广。高效液相色谱法的特点2.SFC与LC的比较分析时间短，由于超临界流体粘度低，可使其流动速率比高效液相色谱（HPLC）快得多，在最小理论塔板高度下，SFC的流动相速率是HPLC的3-5倍左右，因此分离时间缩短。总柱效比LC高，毛细管SFC总柱效可高达百万，可分析极其复杂的混合物，而LC的柱效要低得多。当平均线速率为0.6cm/s时,SFC法的柱效可为HPLC法的4倍左右。SFC的检测器应用广。SFC可连结各种类型的GC、LC检测器，如氢离子火焰(FID)、氮磷检测器（NPD）、质谱（MS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）以及紫外（UV）、荧光（FLD）等检测器。流动相消耗量比LC更低，操作更安全。高效液相色谱法的特点理论塔板数：理论塔板数是色谱分析中的一个重要参数，它来源于塔板理论，是表示色谱柱对样品的分离能力或者是分离效率（柱效）。理论塔板数越高，分离效果越好。塔板理论：塔板理论是色谱学的基础理论，它是将色谱柱看成是一个分馏塔，将分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成某种平衡随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，同时形成新的平衡，直至完全被洗脱出去。柱效:是指色谱柱保留某一化合物而不使其扩散的能力。柱效能:是一支色谱柱得到窄谱带和改善分离的相对能力。色谱柱的有效塔板数越大或有效的塔板高度越低，色谱柱的柱效越好，类似于每个塔板的分离效率相同，有效塔板数越多，最终得到的物质越纯。高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点超临界流体色谱法的分类根据所用的色谱柱分类①填充柱超临界流体色谱（填充柱）②毛细管超临界流体色谱（毛细管柱）根据色谱过程的用途分类①分析型SFC：主要用于常规的分析②制备型SFC：常用超临界二氧化碳作为流动相。超临界流体色谱法的工作原理SFC的流动相：超临界流体(CO2、N2O、NH3等）SFC的固定相：固体吸附剂(硅胶)或键合到载体(或毛细管壁)上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离。超临界流体色谱法的工作原理压力效应：SFC的柱压降大(比毛细管色谱大30倍)，对分离有影响(柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应)；超临界流体的密度在临界压力处受压力最大，超过该点则影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小；超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。例：CO2作为流动相时，当压力改变：7.0→9.0×106Pa，C16H34的保留时间25min→5min。超临界流体色谱法的工作原理超临界流体色谱的流动相和改性剂（一）流动相SFC的流动相为超临界流体。超临界流体的主要特点是在不同压力下对各种样品有不同的溶解能力。其溶解度随超临界流体密度的增加而增加。当两组分的溶解度常数越接近时，，其互溶性就越好。几种常用的超临界流体的溶解能力在相同的压力条件下顺序是乙烷二氧化碳氧化亚氮三氟甲烷，在相同条件下其分离能力是：＜二氧化碳＜氧化亚氮＜三氟甲烷≈乙烷。除溶解性能外，还要与检测器相适应，CO2是最常用的流动相。其临界温度低、压力适中，容易操作，相对便宜，无毒无嗅，安全性好，且在190nm以上无紫外吸收。超临界流体色谱法的工作原理（二）改性剂在SFC中，弱极性或非极性超临界流体流动相如CO2，对于一些极性化合物的溶解能力较差。为了加强其对极性溶质的溶解和洗脱能力，常常向其中加入一定比例的极性溶剂称为改性剂，加入的量一般为1%-5%，以甲醇最常用，其次是其他脂肪醇，表中列出了部分适于二氧化碳的改性剂及应用特性。在分离酸性或碱性化合物时，也可以向CO2流动相中加入酸或碱，使其峰形变锐。超临界流体色谱法的工作原理CO2改性剂检测方法CO2改性剂检测方法甲醇UVDMSFIDC（用量应少于1%）脂肪二甲基亚砜乙二氧甲烷UVUVUVMSUVMS脂肪醇UVMS甲醇UVMSFID四氢呋喃UVMS二氧化碳UVMSFID2-基乙醇UV水UVMSFID常用CO2改性剂超临界流体色谱仪超临界流体色谱仪主要部分有注射泵（高压泵），进样系统，色谱柱，限流器，检测器超临界流体色谱仪1.高压泵SFC常用高压泵主要是螺旋注射泵和往复柱塞泵。一般泵的缸体要冷却至0-10℃，要求工作压力不小于400×105Pa，流量0.01-5.00mL/min范围内可调，并能快速程序升压或程序升密度，且重现性好，压力脉动尽可能小。此外，要求泵体耐腐蚀。过去多数SFC仅有一个泵，当使用二元或多元流动相时，使用预混合钢瓶，使流动相组成随压力降低而变化。现已有两泵SFC系统，一个泵引入CO2或其他主流体，另一个泵引入单一或混合改性剂。通过控制泵速而改变混合流体体积比。超临界流体色谱仪2.进样系统SFC一般采用HPLC手动或自动进样阀。对于填充柱，采用带试样管的Rheodyne型六通进样阀。对毛细管柱，采用类似气相色谱的动态分流及微机控制开启进样阀时间的定时分流进样；亦可与超临界流体萃取（SFE）在线连用柱头进样等。进样重复性不仅与进样方式有关，而且与进样温度、压力有关，需严格控制。超临界流体色谱仪3.色谱柱①填充柱填充柱与HPLC柱相似，基于分配平衡实现分离，柱长可达25cm，分离柱内径0.5-4.6mm。使用粒径为3-10µm的填料填充。如硅胶、-NH2、-CN及C18、C8等化学键合相均可用于SFC。其中以极性填料的分离效果更好。SFC在手性化合物的分离上效果优于HPLC。②毛细管柱较常用的填充毛细管柱内径≤0.5mm，柱长为10-30mm；开管毛细管柱主要是内径为50-100μm化学交连的各种硅氧烷柱或其它类型的交连柱。超临界流体色谱仪4.限流器（阻尼器）超临界流体色谱仪必须装有限流器。它的作用是对系统维持一个合适的压力，为使流体在整个分离过程中始终保持在超临界流体状态；另一方面通过它使流体转换为气体，实现相的转变。当使用氢火焰离子化检测器时，阻力器应放在检测器之前（以保证色谱柱的出口压力缓慢地降至常压）。使用其他（能承受高压的）检测器时，阻力器可放在检测器之后，如紫外检测器。为防止高沸点组分的冷凝，阻力器一般应维持在300-400℃超临界流体色谱仪5.检测器各种GC和HPLC检测器均可用于SFC。使用最多的是氢离子火焰（FID），限流器到FID喷嘴的最佳距离是5-7mm。流动相含有机改性剂时，不适用于FID，因而采用蒸发光散射检测器（ELSD）作为通用检测器。元素选择性检测器，如电子捕获（ECD)、火焰光度检测器（PFD)、氮磷检测器（NPD）等均用于多氯联苯、有机磷、硫、氨基甲酸酯农药等测定。超临界流体色谱仪紫外吸收（UV）检测器是含有机改性剂流动相常用的检测器，要求检测池必须耐高压。各种结构分析检测器，包括质谱（MS）、傅里叶红外光谱（FTIR）、核磁共振（NMR）。此外能用于SFC的检测器还有等离子体发射光谱检测器、电导检测器、荧光检测器等。超临界流体色谱法的应用SFC可弥补GC和HPLC在分析性能上的某些不足，分离效能和分析速度介于两种色谱方法之间。SFC可分析不宜用GC分析的一些物质，如强极性、强吸附性、热稳定性差、难挥发的化合物；它可分析相对分子质量比GC大几个数量级的物质。SFC可分析HPLC难以检测的各种化合物，如无紫外吸收的各种天然产物、高分子聚合物。现在SFC已用于分离分析脂肪酸甘油酯、类脂物、胆固醇、胆汁酸、脂溶性维生素、氨基酸、多肽、石油中高级脂肪烃（C100)、高级脂肪醇、烃基聚硅氧烷、聚乙二醇、聚醚、金属有机化合物、聚烯烃等。超临界流体色谱法的应用分离模式：填充柱SFC柱系统：DikmaODS色谱柱（4.6×250mm，5μm）分析条件：纯的二氧化碳备压：20MPa柱温：90℃从EPA和DHA的分子结构可以看出，EPA和DHA的主要差别在于碳链长度和双键数目的不同，可利用ODS柱对EPA和DHA作用力的差异将两者分开。在试验中考察了操作温度和压力对容量因子和分离度的影响，提高温度和降低备压对分离是有利的。二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在SFC上的分析超临界流体色谱法的应用从色谱图中可以看出EPA与SFC有较好的分离效果超临界流体色谱法的应用化妆品中维生素D2和维生素D3的SFC分析分离模式：填充柱SFC柱系统：ACQUITYUPC22-EP（2.1×100mm，1.7μm）分析条件：A.二氧化碳，B.异丙醇洗脱梯度：0min，1%B，0.5min，1%B，4min，5%B备压：2000psi柱温：50℃检测器：紫外，263nm说明：维生素D2和维生素D3由于结构上极为相似，因此是HPLC分离的难点，目前主要采用正相HPLC分析方法进行分析。采用SFC的检测方法能获得比正相HPLC方法一致或更高的分离度，而且分析时间仅为3.9min左右，效率很高。超临界流体色谱法的应用从图中可知维生素D2和维生素D3的分离效果较好，而且分离时间短012345minTHEENDTHANKYOU