国家级创新训练项目申请书

1中南大学大学生创新训练项目项目申请书项目名称：新型纳米银的制备及其对产ESBLs肠埃希菌抗菌性能的研究申请人：齐天琪所在班级：医学检验1002班指导教师：徐克前学科专业：医学检验所在单位：中南大学湘雅医学院联系电话：[phone]E-MAIL：[e-mail]申请日期：2012年3月中南大学2012年3月2填写说明1．本申请书所列各项内容均须实事求是，认真填写，表达明确严谨，简明扼要。2．本申请书为大十六开本（A4），左侧装订成册。可网上下载、自行复印或加页，但格式、内容、大小均须与原件一致。3．申请人所在学院认真审核，签署意见后，将申请书（一式两份）报送本科生院特色教育办公室。3一、简况项目名称新型纳米银的制备及其对产ESBLs肠埃希菌抗菌性能的研究所属学科检验医学原项目编号CL11254批准经费2万元起止年月2011年9月至2013年6月申请人姓名齐天琪性别女班级医学检验1002身份证号130603199111011266电话[phone]学号2206100212指导教师徐克前职务系主任职称教授电话[phone]项目参与人性别班级学院学号电话谷怡珊女医学检验1002湘雅医学院220610022115116389899谭芮辰女医学检验1002湘雅医学院220610022414789856552刘旭祺男医学检验1002湘雅医学院220610021515116139209杨源青女医学检验1003湘雅医学院220610030215607490121申请人曾参加与本项目相关的科学研究曾参与指导老师有关该课题的相关实验指导教师承担本项目相关的科研课题指导老师曾于2009年指导大学生创新课题《纳米胶体金标记核酸探针快速检测H5N1亚型禽流感病毒》；2010年指导中南大学本科生自由探索研究创新基金项目《纳米银抑制HBV复制的研究》4项目简介（500字左右）肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是在环境、食物、动植物以及人体中广泛存在的一种病原微生物，抗生素的广泛使用乃至滥用导致其变异而产生耐用性，人类健康面临严重的挑战。纳米银是指粒径为1－100nm之间的银颗粒，是金属银的一种特殊形态。它具有广泛的抑制微生物的作用，包括细菌、真菌乃至病毒等。前期我们的研究表明，传统的纳米银对普通的肠埃希菌有抑制作用，而对耐药的产ESBLs肠埃希菌没有明显的抑制作用。本项目拟采用一种新的还原剂HEPES还原硝酸银的方法制备纳米银，HEPES是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，这样可以得到一种颗粒更小、更均一，能进入肠埃希菌质粒中对产ESBLs肠埃希菌有强抑制作用的新型抑菌剂，并对其抑菌效应进行研究。二、课题论证（5000字左右）1研究目的和研究意义1.1研究目的：1.1.1制造分散性好，颗粒尺寸分布范围窄的纳米银颗粒；1.1.2比较新型纳米银的制备方法与传统方法的异同，探讨新方法制银的优越性；1.1.3检测不同浓度纳米银溶液对产超广谱β-内酰胺酶(ESLBs)大肠埃希菌的抑制作用；1.1.4探究纳米银抑菌的的原理与机制。1.2研究意义：1.2.1纳米银的制备方法有很多，化学还原法是制备纳米银最常用的方法之一传统的化学还原法的原理是硝酸银和硫酸银等银盐与适当的还原剂如锌粉、水合肼、柠檬酸钠等在液相中反应、将银离子还原成银，并生长成单质银颗粒。本项目用HEPES还原硝酸银的方法制备纳米银，HEPES是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。此方法具有操作简便、快速，干扰因素少等优点，并且制得的纳米银具有很高的纯度，是一种新型制备纳米银的优良方法，迄今为止，关于这一方法制备纳米银的报道在国内外均少见。1.2.2本实验通过检测纳米银对普通大肠埃希菌和产超广谱β-内酰胺酶(extendedspectrumβ-lactamases，ESBLs)大肠埃希菌的抑菌圈大小来研究纳米银对其的抑菌效果。目前国内外均未发现有关于研究纳米银对产ESBLs大肠埃5希菌的抑制作用的报道，因此本研究具有极大的临床意义。2国内外研究现状肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌属于细菌。目前在德国流行，在英国、法国、荷兰、丹麦、瑞典等国广泛传播的就是肠出血性大肠杆菌。普通大肠杆菌的化脓性炎症尤其是医院内病人发生的严重感染，可用抗生素治疗，如用氨苄青霉素、庆大霉素、头孢菌素等；产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻，一般不需用抗生素，主要采取支持疗法，纠正水和电解质的丢失，并根据病人的情况作对症处理。在长期的抗生素选择之后出现的对相应抗生素产生耐受能力的微生物，统称耐药菌。所谓细菌的耐药性，是指细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。耐药菌的出现增加了感染性疾病治愈的难度，并迫使人类寻找新的对抗微生物感染的方法。但随着抗菌素的广泛使用,以及不合理使用,细菌对抗菌药物出现了耐药,甚至多重耐药性,给人类的健康带来了很大的威胁。多重耐药菌感染已成为患者延长住院时间、增加医疗费用的一大原因。监测数据显示，医院内检出的金黄色葡萄球菌对新青霉素、头孢菌素的耐药率高达70%，大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌对第三代头孢菌素的耐药率超过50%。其中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肠埃希菌就是医院的主要致病菌之一。近几十年来,随着抗菌药物种类的不断增加及广泛应用，ESBLs的严重感染在全球范围内迅速增加[1]。产ESBLs大肠埃希菌对大多数广谱β-内酰胺类抗生素高度耐药，对喹诺酮类、氨基甙类、磺胺类药物多重耐药。ESBLs是由质粒介导的能水解含氧亚氨基的β-内酰胺类抗生素，并可被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸等抑制的一类β-内酰胺酶。氧亚氨基β-内酰胺类抗生素包括第三代头孢菌素如头孢噻肟（CTX）和单环酰胺类抗生素如氨曲南，也包括第四代头孢菌素如头孢吡肟，这些抗生素都有一个含氧亚氨基基团的侧链。ESBLs也能水解各类青霉素，但水解活性低于广谱酶[2]。6纳米银是指粒径为1－100nm之间的银颗粒，是金属银的一种特殊形态。纳米银的制备方法有很多，化学还原法是制备纳米银最常用的方法之一。传统的化学还原法的原理是硝酸银和硫酸银等银盐与适当的还原剂如锌粉、水合肼、柠檬酸钠等在液相中反应、将银离子还原成银，并生长成单质银颗粒。近年来，有一种新型还原剂HEPES用于纳米银的制备，而且具有强的抑制微生物的性能，它对乙肝病毒的DNA复制都有抑制作用[3]。由于其结构单元尺寸介于宏观物质和微观原子和分子之间，使其具有不同于一般材料的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应及量子隧道效应等，使其可以轻易地进入病原体[4]。纳米银粒子尺寸小,表面所占的体积百分数大,表面的键态和电子态与颗粒内部不同,表面原子配位不全等导致表面的活性位置增加,具备了作为抗菌剂的基本条件;具有很强穿透力,能全面充分接触并攻击病原体,从而发挥更强的生物效应,具有安全性高,抗菌范围广,持续杀菌时间长等优点[5]。纳米银通常在较低浓度即可显示出其抗菌活性。有研究表明，纳米银抗菌活性与纳米银的总表面积有关[6]。Pal等报道纳米银的抗菌活性取决于纳米银的形态，球形及棒状的抗菌活性较三角形的高[7]。纳米银不是抗生素类药物，细菌对银不产生耐药性。银是一种最常用的机抗菌剂。纳米银具有较强的抗菌活性，对细菌、真菌、病毒等多种病原微生物有抑制和（或）杀灭能力[8-19]。纳米银对微生物的杀灭作用详见表1。表1纳米银对微生物的杀灭作用微生物种类细菌金黄色葡萄球菌、乙型溶血型链球菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌、无乳链球菌、变形链球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌（MRSE）、伤寒杆菌、肺炎克雷伯菌等真菌白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、、、青霉菌、出芽短梗霉菌等病毒乙肝病毒（HBV）、人免疫缺陷病毒（HIV）、副流感病毒(PIV)、腺病毒、人疱疹病毒Ⅰ型、新城疫病毒（NDV）、H3N2流感病毒等7郑丛龙等人在纳米银体外抗菌作用的实验观察的研究中，应用悬液定量抑菌试验方法,对纳米银抑制细菌繁殖体和酵母菌的效果进行了观察。结果表明：以含纳米银600mg/L的纳米银溶液,在室温下作用60min,对大肠埃希菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌率为100%;含纳米银60mg/L该纳米银溶液对金黄色葡萄球菌和乙型溶血型链球菌的抑制率为100%。含量为600mg/L的纳米银溶液,在室温下作用60min,对白假丝酵母菌、黄曲霉菌和黑曲霉菌的抑制率为100%。随着纳米银浓度增加和作用时间延长,其抑菌作用增强[8]。国外学者亦研究发现，纳米银颗粒可以杀灭致病性细菌、真菌[20-22],而且纳米银的抗菌性远远超过传统的银系抗菌剂，具有传统抗菌剂无法比拟的抗菌效果。目前，纳米银作为一种新型的抗菌剂在医学领域广泛应用：(1)可作为烧烫伤、烧伤植皮中的临床外用药;(2)在妇科,国内开发出的妇女外科抗菌器,可有效抑制引起阴道炎的多种衣原体和支原体;(3)在皮肤科,可用纳米银祛痘凝胶治疗寻常痤疮;(4)在口腔科,应用纳米银可有效抑制多种病原菌的生长；（5）用于安全套和宫内节育器中可抗菌；（6）使用载有纳米银抗菌材料的口罩、防护服、垫材、床单等各种医用纺织类防护用品以减少医源性交叉感染[23]。前期我们的研究表明，传统的纳米银对普通的肠埃希菌有抑制作用，而对产ESBLs肠埃希菌没有明显的抑制作用，我们认为可能与产ESBLs肠埃希菌的ESBLs是由质粒介导的能水解含氧亚氨基的β-内酰胺类抗生素，并可被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸等抑制的一类β-内酰胺酶有关。本项目用一种新的还原剂HEPES还原硝酸银的方法制备纳米银，HEPES是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，这样可以得到一种颗粒更小、更均一，能进入肠埃希菌质粒中对产ESBLs肠埃希菌有强抑制作用的新型抑菌剂。参考文献[1]王若伦,邱正国.我院第3代头孢菌素类药年用量变化与产ESBLs细菌分离率的相关性研究[J].中国药房,2007,18(10):739-740.[2]张阮章,卢月梅.产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌呼吸道分离株的基因分型及耐药性分析[J].中国微生态学杂志,2010,22(7):646-648.[3]LuL,SunRW,ChenR,etal.SilvernanopaarticlesinhibithepatitisBvirus8replication(J).AntiviralTherapy,2008,13(2):253-262.[4]谢小保,李文茹,曾海燕,等.纳米银对大肠杆菌的抗菌作用及其机制[J].材料工程,2008,10(4):106-109[5]刘伟,张子德，等.纳米银对常见食品污染菌的抑制作用研究[J].食品研究与开发,2006,127(5):135-137.[6]BakerC,PradhanA,PakstisL,etal.Synthesisandantibacterialpropertiesofsilvernanoparticles(J).JNanosciNanotechnol,2005,5(2):244-249.[7]PalS,TakYK,SongJM.DoestheAntibacterialActivityofSilverNanoparticlesDependontheShapeoftheNanoparticle?AStudyoftheGram-NegativeB