6 实验六 现代免疫学检测技术：ELISA

实验六现代免疫学检测技术：ELISA1.了解ELISA的原理及其优点，2.掌握试剂盒的使用。3.学习ELISA的实验操作过程及其应用。一、实验目的免疫酶技术（酶免疫测定法）免疫酶技术:将抗原抗体反应的特异性，与酶反应的敏感性相结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体（或抗原，抗抗体）联结，形成酶标抗体（抗原，抗抗体），其与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应进行抗原（抗体）的定性和定量（酶标测定仪），亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA）。二、实验原理ELISA简介1971年瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA—enzyme-linkedimmunosorbentassay）ELISA基本的实验过程•包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化。•抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定。•酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色。ELISA：根据检测目的和操作步骤不向，有以下三种类型的常用方法。酶联免疫吸附实验间接法双抗夹心法竟争法双抗体夹心法双抗原夹心法(1)包被固相抗体（室温放置，厂家完成）(2)加入待检样品（抗原）抗体抗原ELISA检测—双抗体夹心法（测抗原）放大的反应小孔酶标抗体(4)加入酶反应底物后显色（HRP酶与底物反应后,显兰色）底物(3)加入酶标抗体试剂（夹心饼干形成!）ELISA检测—双抗体夹心法（测抗原）ELISA检测—双抗原夹心法（测抗体）与双抗体夹心法区别：（1）包被抗原（2）检测样品待测抗体，如血清等。（3）酶标抗原酶标板酶标仪三、实验内容1.采用双抗原夹心法,测定乙型肝炎表面抗体（HBsAb）,学习乙型肝炎表面抗体诊断试剂盒的使用方法。2.采用双抗体夹心法,测定乙型肝炎表面抗原（HBsAg）,学习乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒的使用方法。1．乙肝病毒表面抗体(HBsAb)诊断试剂盒。预包被微孔条（包被纯化HBsAg）酶结合物：辣根过氧化物酶标记HBsAg（HBsAg-HRP）抗HBs阳性对照抗HBs阴性对照洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释，按说明)底物A（H2O2）、底物B（四甲基联苯胺TMB）和终止液（HCl及2mol/LH2SO4）。四、实验材料2．乙肝病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒。预包被微孔条（包被纯化HBsAb）酶结合物：辣根过氧化物酶标记HBsAb（HBsAb-HRP）HBsAg阳性对照血清HBsAg阴性对照血清洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀，按说明)底物A、B和终止液。3．微量加样器，吸水纸等。四、实验材料•1.待检测样品待测血清4种：1号、2号、3号、4号注意：待测血清是从医院采集的正常血清(人为加进去乙肝表面抗原或者抗体)，但是并不表示血清中不含有可传染的疾病，所以实验中要注意安全。五、实验步骤2.分组：每4人一组，每组有检测HBsAg和检测抗体（抗－HBsAg）的2种试剂盒。反应条各1条,每条含6个反应孔。1个孔做阳性对照，1个孔阴性对照，4个做样品检测。本实验空白对照孔不设。五、实验步骤3.检测方法（1）加样：每孔加待检血清50ul,每次实验各做1个阴性对照和阳性对照。注意：每位同学选择一种待测血清进行检测（见下图）。五、实验步骤阴性阳性待检血清1号,2号,3号，4号……….对照对照1号同学取待测血清1号阴性阳性待检血清1号,2号,3号，4号………….对照对照1号同学取待测血清1号2号同学取待测血清2号2号同学取待测血清2号（1）加样：其他按说明书操作！各50ul血清•(2)每孔加1滴酶结合物,充分混匀，37℃孵育30min。•(3)甩弃孔内液体（在水池中甩弃，不要在实验室中随地甩弃）；•(4)每孔加满洗涤液,静置1min,甩干。同上洗涤重复4次，拍干。五、实验步骤(5)每孔加显色液A,B各1滴,充分混匀，置37℃15min（水浴锅的盖子上面水擦干净）。按以下方法,进行肉眼观察结果:阴性对照孔无色,阳性对照孔蓝色;待测孔显蓝色,为阳性,否则为阴性。（记录颜色！）(6)加终止液：各孔加终止液1滴，反应条取出，放入消毒缸。五、实验步骤4.实验结果及结论五、实验步骤阴性对照孔阳性对照孔待测1待测2待测3待测4结果结论5.作业：按实验报告要求写出并上交实验报告。•HBV属于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原体。•在中国，HBV感染或携带者已超过1.3亿，发病人数超过3000万人。HBV基因组为双链环状DNA，其中有一个单链区。•HBV的抗原组成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)组成。三种抗原具有其相应抗体：HBsAb（抗表面抗原抗体）、HBeAb（抗e抗原抗体）、HBcAb（抗核心抗原抗体）。知识介绍•HBsAg为二聚体糖蛋白，大量存在于感染者血液中，为HBV感染的主要标志；•HBcAg存在于Dane颗粒核心结构表面，为内壳成分，其外被HBsAg覆盖，不易在血循环中检出，但能刺激机体产生抗-HBc，抗-HBcIgM的存在提示HBV处于复制状态；•HBeAg游离于血中，其消长与病毒体消长及DNA多聚酶消长基本一致，故HBeAg为HBV复制及具有强感染性的一个指标；知识介绍•HBeAg刺激机体产生的抗-HBe能与受染肝细胞表面的HBeAg结合，通过补体介导破坏受染肝细胞，抗-HBe的出现是预防后良好的象征。•HBV的主要感染源是患者或无症状的HBsAg携带者，通过血液、体液、母婴传播。•本实验只检测HBsAg及其抗体HBsAb知识介绍HBsAg（本实验测）HBeAg抗-HBs（本实验测）抗-HBe抗-HBc结果分析+----HBV感染或无症状携带者++---急慢性乙肝或携带者++--+“大三阳”急慢性乙肝患者（传染性强）+--++“小三阳”急慢性乙肝感染，趋向于恢复--+++既往感染恢复期----+既往感染或“窗口期”--+--既往感染或接种过疫苗乙肝两对半检测的结果判断方法【注意事项】1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。3．滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。4．洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。5．待测标本不可用NaN3防腐。所有样品都应按传染源处理。知识介绍临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因（非试剂盒本身的原因）1．弱阳性样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。2．测定的重复性差（相同样本两次测定结果不一致）这是典型的由测定操作引起的问题，包括（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；（2）加样过快，孔间发生污染；（3）加错样本；（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；（5）不同批号试剂盒中组分混用；（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；（7）孔内污染杂物；（8）酶标仪滤光片不正确；（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。2．测定的重复性差3．白板（阳性对照不显色）（1）漏加酶结合物；（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。（3）漏加显色剂A或B；（4）终止剂当显色剂使用。4．全部板孔均有显色（1）洗板不干净；（2）显色液变质；（3）加底物的吸光受酶污染；（4）洗板液受酶等污染。