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水中细菌总数与大肠菌群的测定一实验目的1、掌握细菌总数的测定方法2、掌握大肠杆菌的鉴定和计数方法3、巩固无菌操作技术1.细菌总数测定原理用营养琼脂倾注平板，测定被检物在单位重量或体积（g或ml）内所含有的活细菌数量，以判明被检物被细菌污染的程度。二实验原理2大肠杆菌鉴定原理大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否染肠道致病菌的可能。样品中大肠菌群系以100mL（g）检样内大肠菌群最大可能数（MPN)表示。细菌学检验程序样品细菌总数大肠菌群水样稀释或不稀释水样稀释或不稀释第一步------初步发酵试验倾注平板培养（乳糖发酵）37℃24小时37℃24小时菌落计数第二步------平板分离培养（取平均数报告）（转种鉴别培养基）37℃24小时革兰染色镜检第三步-------乳糖复发酵试验报告结果三、实验器材1、恒温培养箱（36℃±1℃）、恒温水浴锅（46℃±1℃）、天平、灭菌培养皿、试管。2、培养基及试剂：乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板（EMB）、牛肉膏蛋白胨培养基1.以1ml无菌吸管吸取样品1ml加入9ml无菌生理盐水，使样品（自来水、饮用水、饮料等）成1：10、1：100、1：1000等几个稀释度；样品（下水道水、牛奶）稀释度要适当高。2.分别在无菌平皿内加入1：100、1：10、原样的样品各1ml，每个稀释度均做一个平板。注意：先加浓度低的样品，再加浓度高的样品3.将冷却45℃的营养琼脂倾注于平皿中，摇匀，置37℃培养24小时。四、实验步骤-细菌总数测定平皿分4部分点数（见图）求同一稀释度的平均菌落数如：A1数+A2数+A334、菌落计数：1）平板菌落数的选择2）稀释度的选择3）菌落数的报告菌落数＜100按实有数报告菌落数＞100采用两位有效数，后面数值四舍五入（也可用10的指数表示）无法计数无法计数报告（注明水样的稀释倍数）5.菌落计数的报告：★稀释度的选择：1.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之2.若有两个稀释度其生长之菌落数均在30-300，则应视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告平均数。若其比值大于2则报告其中较小的数字。3.若所有平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以最高稀释倍数无法计数报告之。稀释度选择及细菌总数报告方法稀释液及菌落数10-110-210-311,36516420—16，40016，000或1.6×10422,760295461.637，75038，000或3.8×10432,890271602.227，10027，000或2.7×1044不可计4，650513—513，000510，000或5.1×105527115—270270或2.7×1026不可计30512—30，50031，000或3.1×1047不可计不可计不可计—10-3无法计数稀释倍数平均菌落数例次两稀释度菌落数之比细菌总数(个/g或个/ml)报告方式(个/g或个/ml)菌落计数的报告:菌落数报告结果1、30~300之间平均菌落数X稀释倍数2、求比值2取较小稀释倍数在30~300之间2取平均数3、300最高稀释度平均菌落数X最高稀释倍数4、30最低稀释菌度平均落数X最低稀释倍数5、300306、无法计数报告无法计数取最接近的X稀释倍数(若有两个稀释度)五、大肠菌群的检测检品胆盐乳糖发酵管伊红美兰平板大肠杆菌菌落纯培养乳糖复发酵管（-）乳糖复发酵管（⊕）1、检样稀释①以无菌操作将检样1mL放于含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。②用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。③另取1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。④根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种3管，每支试管接种1ml。2.乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置36℃±1℃温箱内，培养24h±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行。3.分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃温箱内，培养18h—24h，然后取出，观察菌落形态并做革兰氏染色和证实试验。4.证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1—2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃的温箱内培养24h±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性。5.报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）食品中大肠菌群的MPN值。表1大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN100mL(g）95%可信限1mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×3下限上限0000000001233030609059000001111012330609012051300000222201236090120160000033330123901301601901111000001234070110150510200210111111110123701101501901030230360111122220123110150200240303601111333301231602002402902222000001239014020026010303603702222111101231502002703403070440890222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000≥240003607101500130002400048000大肠菌群测定挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。饮用水、乳、冷饮食品卫生标准的细菌指标指标细菌总数大肠菌群饮用水＜100个/ml＜3个/L消毒牛奶≤30，000个/ml≤40个/100ml瓶装汽水、果味水及果汁类饮料品种≤100个/ml≤5个/100ml五、实验报告（一）、列表记录并计算实验结果（二）、思考题1、怎样判断分离到的微生物是大肠杆菌？2、接种了微生物的培养皿为什么要倒置培养？实验准备（2个样品/组）培养皿：10套/组无菌水：10支（9毫升/支）乳糖胆盐发酵培养基：18支试管、5ml/支100ml伊红美蓝琼脂培养基（EMB）:100ml，4个平板牛肉膏蛋白胨培养基:150ml，6个平板