6.RNA干扰

RNAinterference（RNAi）2/8/2020干扰机制基因沉默转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默。对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致；PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。2/8/2020•何为一倍体？•何为多倍体？2/8/2020•大家关于RNAi的了解情况•单链RNA(ssRNA)•双链RNA(dsRNA)•ssRNA存在于哪里？举例•dsRNA存在于哪里？举例2/8/2020单链RNA病毒根据翻译的意义分为•正义RNA：与mRNA相似，可以直接被宿主细胞翻译成蛋白质•反义RNA：先转义成正义RNA，再翻译成蛋白质2/8/2020Introductionofsmallsegmentsofdouble-strandedRNAleadstospecificdegradationofthecorrespondingmRNA.2006年的诺贝尔生理学奖获得者：AndrewZ.FireCraigC.Mello“沉默”是金定义：RNAi(RNAinterference，RNA干扰)：由与mRNA序列相对应的双链RNA引发的使mRNA降解，从而阻断基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。2/8/2020•RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程；•此外，siRNA本身还是一种极具前景的基因靶向药物，可广泛地用于诸如癌症等疾病的治疗。鉴于siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景，2002年美国《科学》杂志将其评为全球年度十大科学进展之首。2/8/2020RNAi-----RNAinterferencesiRNAs-----SmallinterferingRNAs(小干扰性RNA)dsRNA------doublestrandRNA(双链RNA)RISC------RNA-inducedsilencingcomplex(RNA诱导沉默复合物)Dicer------RNAaseIII—relatedenzymes(RNAaseIII家族成员)PTGS------Post-transcriptionalgenesilencing转录后基因沉默Glossary(术语)(RNA干扰)小RNAsiRNA外源性miRNA内源性早期RNAi：siRNA广义RNAi：siRNA、miRNA2/8/20202/8/2020dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程干扰机制第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶（Dicer酶）切割加工成21~23bp的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。rRNAi过程的功能单元：siRNA•siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。19ntduplex2-3nt’overhangs2/8/2020•Dicer酶，一种特异性的识别dsRNA的核酸酶,负责将dsRNA切割为siRNA：•它属于RNaseⅢ家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA长度存在微小差别。DicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNARNaseIIIdomainconnectorhelixamino-terminalhelicasedomainPAZdomain一种RNaseIII活性核酸内切酶（Dicer）Argonaute家族的PAZ结构域III型RNA酶活性区域RNA解旋酶活性区dsRNA结合区域第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。在ATP酶的作用下，活化的RISC以单链siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基因的沉默。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。干扰机制DicerRISC碱基互补酶解第二步第一步RISC（RNA-inducedSilencingComplex）解旋酶核酸内切酶ArgonauteproteinsiRNAmRNA250KD(inactive)100KD(active)ATP2/8/20202/8/2020RNAi的放大效应机制：•siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。•新合成的长链dsRNA同样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（randomdegradativePCR）2/8/2020许多研究显示RNAi过程中有新的dsRNA分子的合成。当siRNA反义链识别并结合靶mRNA后,siRNA反义链可作为引物,以靶mRNA为模板,在依赖于RNA的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRP)催化下合成新的dsRNA,然后由Dicer切割产生新的siRNA,新siRNA再去识别新一组mRNA,又产生新的siRNA,经过若干次合成2切割循环,沉默信号就会不断放大。干扰机制2/8/2020Characteristics①RNAi是转录(后)水平的基因沉默机制；②RNAi具有很高的特异性；③只有dsRNA才能诱导产生RNAi；④只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰；⑤注射同源dsRNA可以引起内源性mRNA特异性的降解；2/8/2020⑥RNAi抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；⑦RNAi作用迅速，mRNA快速降解；⑧RNAi效应的依赖性，只有连续产生dsRNA才能产生长期效应，否则只产生短暂的沉默反应2/8/2020一、RNAi现象的发现及发展牵牛花（petunias）协同抑制现象cosuppression，应用：RNAi主要通过在转录后（post-transcriptional）水平阻断基因的表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。比如，我们可以按拟定的方式来关闭（shuttingoff）非必需或致病基因的功能。从理论上说，若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明，可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中；这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路。2/8/20201）基因功能研究由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA使目的基因沉默，研究基因的功能。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。2/8/20202）病毒性疾病的治疗RNAi机制作为真核生物基因组免疫系统,抑制外源和内源有害基因表达。利用RNAi技术把与病毒基因具同源性的siRNA引入感染细胞将会抑制病毒的增殖。利用RNAi技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi抑制了HIV-1的coreceptor(辅助受体)-CCR5进入人体外周Ｔ淋巴细胞，不影响另一种HIV-1的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。2/8/2020Randall等证明了针对HCV(丙型肝炎病毒)RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCVRNA降低80倍；将siRNA转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCVRNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等也证明了siRNA特异抑制HCVRNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。2/8/2020Fig3.RNAi的抗病毒机制2/8/20203）肿瘤治疗用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因，(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达，(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。2/8/2020细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用于ICAM-1基因序列特异的siRNA，阻断ICAM-1mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植的移植物心血管病的发生的程度和缺血再灌注损伤。4）抗器官移植排斥反应2/8/20205）药物开发利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快药物开发的研制速度大有益处，因为基因组研究成果和高通量的筛选技术，为更好更快发现药靶和候选药物提供了重要基础。在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因的功能进行分析，有助于搞清药物的作用机制以及与基因编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发现药靶，开发更有效的候选药物。2/8/2020RNAi的研究方法Fig.一般技术路线2/8/2020④在整形外科领域的应用前景N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变,而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。RNA干扰存在的问题•目前RNAi机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。•目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移入体内成为RNAi应用的最大障碍；•如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不清楚；•如何将RNAi技术运用到临床试验•siRNA的稳定性•在多基因家族中的非特异性问题2/8/2020Thanks！2/8/2020