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基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构编码区原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子编码区：非编码区原核细胞的基因结构编码蛋白质，连续不间断编码区：非编码区原核细胞的基因结构①不编码蛋白质。编码蛋白质，连续不间断编码区：非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达。真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点启动子编码区上游真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子编码区上游编码区下游外显子真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子编码区上游编码区下游内含子外显子真核细胞的基因结构编码区非编码区：真核细胞的基因结构编码区非编码区：外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列真核细胞的基因结构编码区非编码区：外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用，上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。真核细胞的基因结构编码区非编码区：外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用，上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。非编码序列：包括非编码区和内含子非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子启动子原核真核基因的结构基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定(核心)1.目的基因主要是指______________________________2.获取目的基因的常用方法一、获取目的基因一、获取目的基因1.目的基因主要是指______________________________编码蛋白质的结构基因2.获取目的基因的常用方法1.目的基因主要是指______________________________编码蛋白质的结构基因2.获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）鸟枪法和人工合成（3）利用PCR技术扩增一、获取目的基因1.基因文库(一)从基因文库中获取目的基因1.基因文库(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库限制酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装1)基因组文库(Genomiclibrary)是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。基因文库基因文库cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库.2)cDNA文库(cDNAlibrary)基因重组反转录酶mRNAcDNA基因组DNA文库与cDNA文库的比较cDNA文库基因组文库大小启动子内含子物种间基因交流小大无有无有可以部分基因可以依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。如何从基因文库中得到所需要的基因？寻根问底为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。①鸟枪法：(直接分离法)用限制酶切成许多片断（二）.鸟枪法和人工合成法获得目的基因①鸟枪法：供体细胞中的DNA(直接分离法)（二）.鸟枪法和人工合成法获得目的基因①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段限制酶(直接分离法)（二）.鸟枪法和人工合成法获得目的基因①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶分别与运载体连接(直接分离法)（二）.鸟枪法和人工合成法获得目的基因①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶分别与运载体连接受体细胞分别导入(直接分离法)（二）.鸟枪法和人工合成法获得目的基因产生特定性状外源DNA扩增目的基因分离②反转录法：（二）.鸟枪法和人工合成法获得目的基因②反转录法：基因重组反转录酶mRNAcDNA（二）.鸟枪法和人工合成法获得目的基因mRNA反转录cDNA(互补DNA）DNA聚合酶双链DNA②反转录法：基因重组反转录酶mRNAcDNA（二）.鸟枪法和人工合成法获得目的基因③人工合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。③人工合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列③人工合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列推测③人工合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测③人工合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成③人工合成DNA法：如何从基因文库中得到所需要的基因？①概念：③条件：_____________________________(前提条件)_______________________、___________、_____________________.②原理：__________(三)利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物_____复制______________的核酸合成技术。③条件：_____________________________(前提条件)_______________________、___________、_____________________.②原理：__________聚合酶链式反应体外特定DNA片段(三)利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物_____复制______________的核酸合成技术。③条件：_____________________________(前提条件)_______________________、___________、_____________________.②原理：__________聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制(三)利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物_____复制______________的核酸合成技术。③条件：_____________________________(前提条件)_______________________、___________、_____________________.②原理：__________聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶)(三)利用PCR技术扩增目的基因复性：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性复性变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA延伸利用PCR技术扩增目的基因利用PCR技术扩增④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：⑥过程：④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：指数2n⑥过程：④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增⑥过程：④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增⑥过程：变性、复性、延伸三步曲二、基因表达载体的构建1、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因:是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来2.过程:二、基因表达载体的构建质粒DNA分子2.过程:二、基因表达载体的构建质粒DNA分子限制酶处理同一种2.过程:二、基因表达载体的构建质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因同一种2.过程:二、基因表达载体的构建质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶同一种2.过程:二、基因表达载体的构建质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种2.过程:二、基因表达载体的构建3.基因表达载体的作用3.基因表达载体的作用a.使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b.同时使目的基因能表达和发挥作用①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化——目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_______和________的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞转化——方法目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_______和________的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_______和