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第一部分:微生物的应用实验目的:1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基础知识：(一)微生物：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称．(二)细菌的常识1、结构2、分裂3、生殖4、变异类型5、在基因工程中的应用大肠杆菌细菌的外形与大小大肠杆菌属于杆状菌根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分为两大营养类型。自养菌:异养菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌细菌的营养类型光能自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌细菌的革兰氏染色革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌☆培养基培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。固体培养基和液体培养基、半固体培养基。1.培养基的类型(三)细菌的培养成分区别：琼脂4.培养基的用途液体培养基：扩增细菌、工业生产固体培养基：纯化（分离），鉴定、保藏菌种单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。☆菌落液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长☆无菌技术1.无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。成功地培养微生物的关键。（１）消毒定义：2.消毒与灭菌的概念及两者的区别（2）灭菌的定义：3.常用的消毒与灭菌的方法是指杀灭病原微生物的方法。是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法1、灼烧灭菌灭菌的方法：2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：1kg/cm2、121℃下维持15-30min.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。1（四）大肠杆菌的划线分离分离方法:划线分离法和涂布分离法（四）大肠杆菌的划线分离注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养12~24h1、划线分离法1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一（五）大肠杆菌分离后保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃5.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌所污染?转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。【课堂练习】例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量D例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（）A.防止杂菌污染B.接种前菌种要进行灭菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前B（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养。（4）表中营养成分共有类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是。（6）右表中各成分重量确定的原则是。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分。固氮微生物3调整pH依微生物的生长需要确定琼脂（或凝固剂）