细胞实验的基本操作

细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。通常，除少数特别注明对DMSO敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。1、贴壁细胞的传代具体操作如下：1.1、传代前准备：1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。1.1.6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。1.1.7、从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞，并做好记录。1.1.8、细胞培养瓶经用75％酒精擦拭后，再放入超净台。1.2、胰蛋白酶消化：1.2.1、将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，打开瓶盖，靠近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗2－3次，沿壁（无细胞的一面）缓缓加入适量消化液（胰蛋白酶液），轻轻摇晃。注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。1.2.2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。1.3、吹打分散细胞：1.3.1、弃去大部分消化液（仅留少量在瓶内），并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后加入新鲜的培养液，再用吸管轻轻吹打成细胞悬液（尽可能不要出现泡沫，否则对细胞有损伤〕1.4、分装稀释细胞1.4.1、将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。1.4.2、倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等。1.5、继续培养：1.5.1、用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。2、悬浮细胞的传代悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。三、细胞的冻存细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。1、具体操作如下：1.1、从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存，但最好选择对数增长期细胞，已长满的细胞冻存复苏后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。1.2、贴壁细胞经消化、离心（1000～1500rpm，5min）收集，悬浮细胞经离心收集；1.3、大约106个细胞加入1ml冻存液（10％DMSO+90%血清），用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；1.4、加入到冻存管中，每个冻存管加1－1.5ml的细胞悬液；密封；1.5、在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；1.6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内，管置于4℃半小时，然后置于-20℃两小时，再置于-70℃两小时，然后置于液氮上方过夜；第二天将细胞置于液氮中；1.7、记下冻存管存放的位置，作好冻存记录（冻存的细胞名称、代数、冻存日期等）。2、注意事项：2.1、使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。2.2、不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。2.3、注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。2.4、细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的。但为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次，观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。四、细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作如下：1、准备工作：取一瓶传代的细胞，按上述二的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以使用。2、细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法：用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测单细胞悬液。3、细胞计数：2.1、盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.2、制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液（如5滴）到一离心管中，加入等体积台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可省略台盼蓝染色步骤。2.3、、将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。2.4、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。2.5、计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3；而1ml＝1000mm3细胞计数要点：①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；②要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。③取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；④数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。⑤操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。注：4％台盼蓝母液的配制：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4％。五、细胞活力的测定1.染料排斥试验：其原理是细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞则能阻止该染料进入细胞内。借此可鉴别死细胞和活细胞。常用的染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等。以台盼蓝染色为例。步骤同上述细胞计数的操作步骤。注意以下几点:①计数：在3－10min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞（死细胞被染成淡蓝色，活细胞则拒染）。②台盼蓝染色时，时间不宜太长，否则活细胞也会着色，从而干扰计数。③活细胞率（％）＝活细胞总数/(活细胞总数＋死细胞总数)×100％2、MTT比色实验：可测定测药物或病毒的IC50原理：活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中。用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于酶标仪上测定光吸收值。紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和功能状态相关。2.1、将细胞接种于96孔板上，密度为大约105个/ml，每孔接种100μl；2.2、培养至对数生长期加入待测样品；2.3、作用一定的时间之后，加入三蒸水配制的5μg/ml的MTT溶液，每孔20μl；2.4、37℃温育4小时；2.5、取出培养板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀；如果是悬浮细胞则用板离心机离心后除去上清；2.6、每孔加入100μl的DMSO，摇床上摇动30分钟以使沉淀溶解；2.7、用酶联免疫检测仪（DNAExpert）在595nm（或490nm）波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值（OD值），按下列公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率：细胞存活率（％）＝治疗组OD值/对照组OD值×100％2.8、求出各药物（或病毒）浓度下的OD值占对照OD值的百分比，用此百分比对药物（或病毒）浓度作图；在所得的曲线上，百分比值为50时所对应的浓度就是IC50值。或根据各浓度下细胞的存活率，采用Logit法计算IC50。六、细胞的运输装运细胞的方法有两种：1、冷冻贮存运输即利用特殊内内盛液氮或干冰冻存，保存效果较好，但较麻烦，且不能长时间运输，多需空运。2、充液法2.1、选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。若空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。2.2、妥善包装、运输。一般在四五天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长则细胞活力下降。2.3、到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液量，置37℃培养,次日传代。注：从其他研究室所取细胞时，应注意了解细胞的性状、培养液、培养时的注意事项等【细胞转染】一、脂质体转染（Lipofetmiane2000）1、转染前细胞的处理（以24孔板培养为例）：贴壁细胞：在转染前一天，在24孔板内铺上0.5×105细胞，500ul无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到80％～90％的汇合率。悬浮细胞:在制备混合物前，将4—8×105细胞用无抗生素培养基培养铺铺于24孔板内。2、转染方法（以质粒DNA转染为例）2.1、将DNA质粒溶于50ul无血清的Opti－MEMⅠReducedSerumMedium中。混合均匀。2.2、将适量Lipofectamine2000溶于50ul无血清的Opti－MEMⅠ中，混合均匀。在室温下孵育5分钟（在25分钟内进行步骤c）。2.3、孵育5分钟后，将上述两种混合物混合（总体积100ul）。轻轻混合均匀在室温下孵育25分钟（可能出现雾状沉淀）。复合无在室温下六小时内稳定。2.4、在24孔板中每孔加入100ul的复合物以及适量培养基。十字法混合均匀。2.5、细胞在37。CCO