细胞工程 干细胞与诱导多能干细胞

LOGO第十一章胚胎干细胞和诱导的多能干细胞(iPS)(GPDselection),whoseumbilicalcordstemcellscouldcurehissix-year-oldsisterMolly'sFanconianemia.Grady,Denise.Babyconceivedtoprovidecelltransplantforhisdyingsister.TheNewYorkTimes,October4,2000(PGD).、2000年干细胞研究被美国《科学》杂志评为年度世界十大科技突破之一，2003年胚胎干细胞研究被《科学》杂志评为该年度世界十大科学突破之一。2007,2008年iPS均被《科学》杂志评为该年度世界十大科学突破之一。组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已经成为干细胞应用的主要方向。干细胞的基本概念胚胎干细胞诱导的多能干细胞干细胞的法律、伦理道德干细胞(StemCell)的基本概念定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。Stemcellsarecellsfoundinmost,ifnotall,multi-cellularorganisms.Theyarecharacterizedbytheabilitytorenewthemselvesthroughmitoticcelldivisionanddifferentiatingintoadiverserangeofspecializedcelltypes干细胞分类全能干细胞，包括：胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)、生殖干细胞（embryonicgermcells,EG）：具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。诱导的多能干细胞(iPS):类似胚胎干细胞干细胞本身不是终末分化细胞；干细胞能无限增殖分裂；干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运--保持为干细胞或分化为特定细胞。干细胞的主要特征(EScells)哺乳动物胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）一般是指从早期胚胎经体外分化抑制培养分离出来的具有全能性的细胞。ES细胞是由Evans和Kauf-man1981年首次从小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。1981年，Evans和Martin分别成功的分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞1995年，Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎干细胞。1998年，Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞1998年，建立了第一株人类生殖干细胞2000年，Reubinoff等建立了两株人胚胎干细胞。一胚胎干细胞发展简史年美国有两个组分别培养出了人胚胎干细胞：JamesA.Thomson的研究组从人胚胎组织培养出干细胞株。方法是：人卵体外受精后，胚胎培养到囊胚，取内细胞团，建细胞株。测试细胞株的细胞表面marker和酶活性，证实是胚胎干细胞。每个胚胎可取得15-20个细胞用于培养。JohnD.Gearhart领导另一研究组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。方法是：从受精后5-9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞(primordialgermcell)。由此培养的细胞株，证实具有全能干细胞的特征。衍生自囊胚的内细胞团(InnerCellMass)或胚胎生殖细胞；2.永生化(immortal)；3.能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.能参与胎儿所有组织的发育过程；二胚胎干细胞的性质与成纤维细胞共培养，分离胚胎生殖嵴细胞ES细胞非分化增殖胚胎干细胞的鉴定定向诱导分化成体干细胞功能细胞:Nervecell发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞(embryonicgerminatecells)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞(embryonalcarcinoma,EC)治疗性克隆：体细胞核移植（SCNT）去核卵细胞+体细胞核克隆囊胚分离内细胞群ES细胞1、干细胞来源的方法，这样得到的囊胚数量少，质量也可能不高，由此会影响分离ES细胞的效率。卵细胞去核培养、转入体细胞核，体外培养，获得高质量的去透明带囊胚，由此囊胚进一步分离得到胚胎干细胞。为什么用体细胞核移植胚胎？)延缓胚胎着床--外源激素改变母体生殖激素水平b)分离ICM--去除滋养层细胞，消除竞争性抑制增殖作用以及分化诱导作用c)脱带处理--酶处理法或机械切割去除透明带d)离散卵裂--酶法或机械方法分散成单个卵裂球2、胚胎干细胞的分离、培养条件分离培养ES细胞首先需要解决的问题就是阻止引起分化基因的激活与表达，以实现分化抑制，保证细胞的全能性。常用的分化抑制物有三种:饲养层--促细胞增殖和抑细胞分化条件培养基--刺激增殖和抑制分化分化抑制因子--抑分化饲养层是指丝裂霉素C处理细胞单层，阻断细胞有丝分裂后所得到的细胞单层。可以合成和分泌促有丝分裂因子FGF和细胞分化抑制因子LIF条件培养基是指培养过细胞并含有细胞分泌物的细胞培养液。含有分泌的生长因子，简单，消除饲养层细胞的干扰，免受丝裂霉素C的影响。LIF最常用，可用于ES细胞的分离和维持。胚胎干细胞具有以下特点：细胞内碱性磷酸酶活性高端粒酶活性高不被Hoechst33342和Rhodamine123染色胚胎阶段细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤分化能力：可诱导分化为各种成体干细胞4、胚胎干细胞的鉴别碱性磷酸酶的表达许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原(SSEA－1)。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA－1的表达。小鼠SSEA－1的表达自8-细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。细胞形态学鉴定：依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。核型分析：ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验鉴别方法碱性磷酸酶（AKP）染色：以是否出现阳性反应确定SSEA-I免疫荧光标记：第1抗体，SSEA－1（鼠抗ES细胞单克隆抗体）。样本在激光共聚焦图像系统下观察,结果依细胞是否出现荧光作出判断。鉴别方法－＋SSEA-3＋＋SEA-4＋＋TRA-1-60＋＋TRA-1-81＋＋AKP＋＋Oct-4＋未知端粒酶活性＋＋滋养细胞＋＋培养条件滋养细胞＋无血清培养＋bFGFLIF＋bFGF＋Forskolin、胚胎干细胞的体外诱导分化人ES细胞具有多向分化潜能,能分化为属于内胚层、中胚层和外胚层范畴的多种类型细胞：包括神经细胞、肝细胞、造血母细胞、分泌胰岛素细胞、心肌细胞、内皮细胞等。这一特性使其可被用来治疗各种疾病，如帕金森病、肝病、血液病、糖尿病、心肌梗塞等。但是如何抑制hESC在体外的自我分化，并诱导其分化为我们需要的细胞，是面临的一个重大问题。干细胞诱导分化的常用方法加入诱导细胞分化的因子或化学物质，VEGF、bFGF、DMSO和RA等将ES细胞与特定的细胞共培养将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞------------------------------------------------造血细胞RA胚胎干细胞-------------------------------------