细胞总RNA提取及逆转录

分子生物学实验1、每组同学做一份实验；2、遵守实验室规则，穿白衣；3、同学们在听课时要作好记录;4、上课时间。～欢迎大家参加分生实验课的学习！1.实验成绩考核占总成绩15%。2.每次实验报告5分含随堂测试，共三次，合15分。3.缺实验课成绩者，本课程不予通过。【每名同学的3个实验报告放在一起，最后一次实验课交。学生交卷后签名。教师按学号排卷。】2013年五年制实验课考试形式1.加样器2.离心机先介绍本轮实验中两种常用仪器的使用方法3、根据取样量，选择合适量程的加样器。顶部标记加样器的最大量程，分别为：20l:0.5~20l100l:20~100l1000l:200~1000l一、加样器的使用及注意事项1、用途——微量吸取液体2、每组3支加样器Q：如果要吸取5μl、50μl、150μl、500μl的液体，应选择哪个加样器?练习：加样器读数为100，实际体积各为多少?4、如何调节？(1)首先观察目前的读数,假设为050:最大量程为20l的加样器—5l最大量程为100l的加样器—50l最大量程为1000l的加样器—500l(2)顺时针调节---读数变小逆时针调节---读数变大(3)注意：调节前，加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。5、加样器使用步骤：1）选择加样器,观察读数,调节读数。安装吸头要紧密(不要用手直接拿吸头)，安装后旋转固定一下。2）在液面外，先按到第一挡。3）将吸头插入液面下的适当深度:过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。4）缓慢松开拇指,吸取液体。完全放开拇指后，停留半秒钟。急于离开液面，易吸入空气。5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去6）贴容器内壁，加样器推到第二挡将液体匀速打出。(吸头内有液体时，不能将加样器平放或倒置，液体会倒流损坏加样器！)7)观察吸头内液体是否完全打出，将吸头弃于废物盒内。第一挡为实际读数体积，第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。1、打开电源2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。3、将样品标记好并配平,对称放入离心机（管的连接处朝外）。4、设定离心的转速和时间。5、统一离心。TeamWork二、离心机的使用及注意事项实验一、细胞总RNA的提取及逆转录实验内容：1、小鼠肝脏组织总RNA的提取2、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳3、以总RNA为模板的逆转录反应一、真核细胞的总RNA1、mRNA:1-5%5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。1）免受核酸酶破坏，2）起始、促进蛋白质合成。3`poly(A)尾巴结构20--200个A.翻译所必需。起始密码：AUG终止密码：UAA,UAG,UGA。2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大亚基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt小亚基40S:18S=1874nt•第一步：提取小鼠肝脏组织的RNA二、RNA提取的注意事项RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性RNase污染A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C.一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。D.玻璃器材、水都应该经过去RNase处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase活性：RNase抑制剂。RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。1)发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。将1mLTrizol试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mL的Trizol试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。4)室温孵育10min。三、RNA提取的实验操作1、异硫氰酸胍法：GuSCN是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性RNase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。特点：需低温操作，但价格经济。2、Trizol试剂（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总RNA，简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。课间介绍RNA提取的几种方法RNase抑制剂介绍1、DEPC(二乙基焦炭酸盐)最常用的RNase抑制剂:与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。有效浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。用于浸泡各种器材。灭活条件：高压。在Tris溶液中半衰期为1.25min。试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制,高压)储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4C，或液氮中。2、肝素：使用浓度：0.1—10mg/ml效果:37C时，可抑制95%的RNase活力。如果与DEPC联合应用，具有极强的抑制效果。5)加入200l氯仿，震荡混匀20-30s，室温放置5min（此期间液体开始分层，此时不要轻易搅动液体）。６)10000rpm，离心5min。RNA(清澈透明)DNAProtein7)将清澈透明的上层水相转移至另一离心管中。三、RNA提取的实验操作8)沉淀RNA：加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。10000rpm，离心10min。弃上清。９)加1ml75%乙醇洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)10)7500rpm离心1min，弃上清。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。12)室温干燥3－5min。（干燥的时间由RNA沉淀大小决定）（干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）注意事项：RNA:避免放在37C孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。RNApellet：透明胶样干燥后应该无色透明13）RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O13.5l，加到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。14)吸出4.5l溶液放到冰上备用(将用于电泳)。15)剩余9l溶液放到冰上备用（将用于RT－PCR）。注意：RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。避免气泡的方法：用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯为止。逆转录酶：存在于逆转录病毒体内。常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC。以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNA－cDNA。RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。•第二步：逆转录反应AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC,annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC,RTasemRNAmRNAcDNA10min1-2h•RT第一步：打开RNA链之间的二级结构，使OligodT特异性地结合到PolyA尾。总RNA9lOligodT(0.05g/ml)1l(终浓度：2.5ng/ml)轻弹管底混合，置65℃水浴10min，然后立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。在水浴10分钟时，开始RNA电泳。按照下列方法进行RT反应：RNA的变性（甲醛变性法）：打开RNA分子二级结构，其分子量和电泳距离相关。5×甲醛变性缓冲液2l甲酰胺10l37%甲醛2lRNA样品4.5l上样缓冲液3l混匀后，21.5l直接电泳上样（100伏，10－30分钟）上样前可先预电泳5min。注意:电泳槽的清洁！所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。琼脂糖凝胶要新鲜配制！紫外透射仪观察电泳结果•第三步：RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂：5RT-buffer4lRNasin(40U/ml)1ldNTPs(10mmol/L)4lAMV1l轻弹管底混合，置42℃水浴1h。将上述反应移至68℃水浴10min（灭活RTase），并冰浴，保存备用。混匀后，可用离心机甩一下基本过程同DNA电泳一样，但：1.必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；2.因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行变性电泳以打开其空间结构，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。RNA电泳RNA电泳结果rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。分析本次实验结果：28S、18S和5S的比例。RNA电泳结果分析RT引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。关键点：•RNA是否充分溶解•根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用1mlTrizol试剂提取出来的总RNA适合于20l体积的逆转录反应体系。•引物的量是否合适•高温退火避免OligodT锚锭点错误，同时，打开RNA链之间的二级结构，利于RT。•退火后一定迅速放在冰上实验报告思考题：1.提取细胞内RNA时，如何防止RNA酶的污染？2.如何分析RNA变性电泳的结果，可以据此准确判断RNA是否降解吗？为什么？实验结束后：•整理实验台；•交实验报告；•值日生值日。