分子生物学实验1、每组同学做一份实验;2、遵守实验室规则,穿白衣;3、同学们在听课时要作好记录;4、上课时间。~欢迎大家参加分生实验课的学习!1.实验成绩考核占总成绩15%。2.每次实验报告5分含随堂测试,共三次,合15分。3.缺实验课成绩者,本课程不予通过。【每名同学的3个实验报告放在一起,最后一次实验课交。学生交卷后签名。教师按学号排卷。】2013年五年制实验课考试形式1.加样器2.离心机先介绍本轮实验中两种常用仪器的使用方法3、根据取样量,选择合适量程的加样器。顶部标记加样器的最大量程,分别为:20l:0.5~20l100l:20~100l1000l:200~1000l一、加样器的使用及注意事项1、用途——微量吸取液体2、每组3支加样器Q:如果要吸取5μl、50μl、150μl、500μl的液体,应选择哪个加样器?练习:加样器读数为100,实际体积各为多少?4、如何调节?(1)首先观察目前的读数,假设为050:最大量程为20l的加样器—5l最大量程为100l的加样器—50l最大量程为1000l的加样器—500l(2)顺时针调节---读数变小逆时针调节---读数变大(3)注意:调节前,加样器读数正处于最大量程或最小量程时,如果向错误方向调节,马上会超出量程,将会损害加样器的精度。5、加样器使用步骤:1)选择加样器,观察读数,调节读数。安装吸头要紧密(不要用手直接拿吸头),安装后旋转固定一下。2)在液面外,先按到第一挡。3)将吸头插入液面下的适当深度:过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。4)缓慢松开拇指,吸取液体。完全放开拇指后,停留半秒钟。急于离开液面,易吸入空气。5)抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去6)贴容器内壁,加样器推到第二挡将液体匀速打出。(吸头内有液体时,不能将加样器平放或倒置,液体会倒流损坏加样器!)7)观察吸头内液体是否完全打出,将吸头弃于废物盒内。第一挡为实际读数体积,第二挡为帮助彻底打出液体,避免吸头内液体残留。1、打开电源2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。1代表转速盘上方的数据,2代表下方的数据。3、将样品标记好并配平,对称放入离心机(管的连接处朝外)。4、设定离心的转速和时间。5、统一离心。TeamWork二、离心机的使用及注意事项实验一、细胞总RNA的提取及逆转录实验内容:1、小鼠肝脏组织总RNA的提取2、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳3、以总RNA为模板的逆转录反应一、真核细胞的总RNA1、mRNA:1-5%5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。1)免受核酸酶破坏,2)起始、促进蛋白质合成。3`poly(A)尾巴结构20--200个A.翻译所必需。起始密码:AUG终止密码:UAA,UAG,UGA。2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大亚基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt小亚基40S:18S=1874nt•第一步:提取小鼠肝脏组织的RNA二、RNA提取的注意事项RNA酶:广泛存在:灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定:耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性RNase污染A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。(试剂应该专用)C.一次性塑料器材最好是新开封,(DEPC水处理后)高压灭菌。D.玻璃器材、水都应该经过去RNase处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase活性:RNase抑制剂。RNA分离的关键因素:避免RNA酶的污染。1)发放口罩、帽子、手套,每个组来一个人领取。将1mLTrizol试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织,组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mL的Trizol试剂中,盖紧盖,上下颠倒混合2min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。4)室温孵育10min。三、RNA提取的实验操作1、异硫氰酸胍法:GuSCN是一种强的蛋白质变性剂,裂解细胞的同时,还能有效地抑制内源性RNase的活性,通过有机溶剂的分步抽提,可获得纯度较高的细胞总RNA。特点:需低温操作,但价格经济。2、Trizol试剂(商品化产品)特点:在室温下可以提取细胞总RNA,简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾,利用寡聚dT纤维素结合mRNA,将其从细胞总RNA中分离出来。课间介绍RNA提取的几种方法RNase抑制剂介绍1、DEPC(二乙基焦炭酸盐)最常用的RNase抑制剂:与蛋白质中的组氨酸结合,使蛋白质变性。有效浓度:0.05%---0.1%(DEPC水),室温磁力搅拌20分钟。用于浸泡各种器材。灭活条件:高压。在Tris溶液中半衰期为1.25min。试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制,高压)储存方法:不能用聚苯乙烯器皿。4C,或液氮中。2、肝素:使用浓度:0.1—10mg/ml效果:37C时,可抑制95%的RNase活力。如果与DEPC联合应用,具有极强的抑制效果。5)加入200l氯仿,震荡混匀20-30s,室温放置5min(此期间液体开始分层,此时不要轻易搅动液体)。6)10000rpm,离心5min。RNA(清澈透明)DNAProtein7)将清澈透明的上层水相转移至另一离心管中。三、RNA提取的实验操作8)沉淀RNA:加入0.5ml异丙醇,上下颠倒混匀,室温放置10min。10000rpm,离心10min。弃上清。9)加1ml75%乙醇洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入,不要搅动沉淀)10)7500rpm离心1min,弃上清。再离心几秒钟,将管壁液体(用加样器)完全移净。用TriZol试剂提取总RNA时,全程均在室温进行。当RNA沉淀用水溶解后,应该注意在冰上操作,操作要迅速。12)室温干燥3-5min。(干燥的时间由RNA沉淀大小决定)(干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状,沉淀要充分干燥但避免过分干燥,此步骤非常关键)注意事项:RNA:避免放在37C孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥,微量乙醇残留,容易造成RT的失败,但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。RNApellet:透明胶样干燥后应该无色透明13)RNA的溶解:用加样器吸取冰冷DEPC-H2O13.5l,加到RNA上,反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。14)吸出4.5l溶液放到冰上备用(将用于电泳)。15)剩余9l溶液放到冰上备用(将用于RT-PCR)。注意:RNA沉淀的溶解一定要耐心充分,一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小,要避免出现气泡影响RNA的溶解。避免气泡的方法:用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体判断溶解程度:吹打时液体流动不拐弯为止。逆转录酶:存在于逆转录病毒体内。常见有哺乳动物型37oC,禽类型42oC。以mRNA为模板的DNA聚合酶,形成与RNA碱基相互补DNA链,后者称为互补DNA-cDNA。RNAaseH的活性:切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。•第二步:逆转录反应AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC,annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC,RTasemRNAmRNAcDNA10min1-2h•RT第一步:打开RNA链之间的二级结构,使OligodT特异性地结合到PolyA尾。总RNA9lOligodT(0.05g/ml)1l(终浓度:2.5ng/ml)轻弹管底混合,置65℃水浴10min,然后立即冰浴2min(防止RNA形成二级结构)。在水浴10分钟时,开始RNA电泳。按照下列方法进行RT反应:RNA的变性(甲醛变性法):打开RNA分子二级结构,其分子量和电泳距离相关。5×甲醛变性缓冲液2l甲酰胺10l37%甲醛2lRNA样品4.5l上样缓冲液3l混匀后,21.5l直接电泳上样(100伏,10-30分钟)上样前可先预电泳5min。注意:电泳槽的清洁!所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。琼脂糖凝胶要新鲜配制!紫外透射仪观察电泳结果•第三步:RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳第二步:向上述反应溶液中依次加入下列试剂:5RT-buffer4lRNasin(40U/ml)1ldNTPs(10mmol/L)4lAMV1l轻弹管底混合,置42℃水浴1h。将上述反应移至68℃水浴10min(灭活RTase),并冰浴,保存备用。混匀后,可用离心机甩一下基本过程同DNA电泳一样,但:1.必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液,所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解;2.因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果,因此电泳时应在变性剂存在下进行变性电泳以打开其空间结构,常用的变性剂为甲醛和戊二醛。RNA电泳RNA电泳结果rRNA可以作为内部Marker分子,通过观察rRNA的两条带(28S和18S)的比例,可以判断所提取mRNA是否存在降解。RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功,也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法,因为在电泳过程中RNA可能发生降解。分析本次实验结果:28S、18S和5S的比例。RNA电泳结果分析RT引物的用量非常少,因为模板量是固定的,而且只进行一次反应。关键点:•RNA是否充分溶解•根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积,通常利用1mlTrizol试剂提取出来的总RNA适合于20l体积的逆转录反应体系。•引物的量是否合适•高温退火避免OligodT锚锭点错误,同时,打开RNA链之间的二级结构,利于RT。•退火后一定迅速放在冰上实验报告思考题:1.提取细胞内RNA时,如何防止RNA酶的污染?2.如何分析RNA变性电泳的结果,可以据此准确判断RNA是否降解吗?为什么?实验结束后:•整理实验台;•交实验报告;•值日生值日。