5.免疫组化技术-实用篇

免疫组织化学（实用篇）(immunohistochemistry)临床病理诊断中常用的抗体简介人体组织细胞分类•上皮细胞：包括鳞状上皮，腺上皮，尿路上皮。•间叶组织：包括脂肪，肌肉，血管，纤维结缔组织，骨和软骨组织，间皮。•神经组织：神经元，胶质细胞，神经纤维。•淋巴造血：淋巴细胞，粒细胞，浆细胞，单核细胞。•内分泌和神经内分泌组织：甲状腺，肾上腺，垂体，胰腺的内分泌腺，各器官的神经内分泌细胞等•其他：黑色素细胞，性腺常用上皮性标记物细胞角蛋白（cytokeratin,CK）上皮膜抗原（epithelialmembraneantigen,EMA）癌胚抗原（carcinoembryonicantigen,CEA）其他：villin，Moc-31，MUC（粘蛋白）系列等Cytokeratin（keratin或CK）•上皮细胞的骨架形成蛋白（中间丝），维持上皮细胞的结构和功能•分为I型和II型(酸性和碱性或中性），编码基因分别位于17q21.2和12q13.13，共54个基因•表达方式与组织类型和细胞分化程度有关，具有高度的特异性•蛋白具有不同的分子量和等电点•细胞中keratin常成对出现（酸性和碱性配对出现）根据氨基酸序列，将Keratin按分子量和等电点进行二维分类CK抗体广谱的细胞角蛋白抗体特殊的细胞角蛋白抗体常用的CK抗体AE1/AE3:（CKpan）最常用，胞浆呈细丝状阳性正常上皮细胞阳性表达，肝细胞阴性。在其他肿瘤，如小细胞癌，尿路上皮癌，室管膜瘤，胸腺瘤，间皮瘤，上皮样肉瘤，上皮样血管内皮瘤，平滑肌肉瘤，滑膜肉瘤等常呈阳性表达常用的CK抗体CK7和CK20：分子量为54KD,正常乳腺，肺，尿路上皮阳性表达，胃肠道，肝细胞，前列腺阴性表达主要用于乳腺癌，肺腺癌与胃肠道癌的诊断与鉴别诊断胰腺癌，胆管癌，卵巢和子宫内膜腺癌，尿路上皮癌阳性表达。卵巢粘液性癌，前列腺癌，肝癌阴性表达与CK20和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价值。常用的CK抗体CK7和CK20：分子量46KD，正常胃肠道，尿路上皮，Merkel细胞阳性表达，肝细胞，乳腺，肺阴性表达主要用于胃肠道腺癌，卵巢粘液性癌，Merkel细胞癌的诊断鳞癌，甲状腺肿瘤，胸腺瘤阴性表达胆道和胰管的腺癌，小肠类癌，前列腺和间皮阳性表达与CK7和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价值。常用的CK抗体CK5/CK6：分子量为58KD和56KD的角蛋白，存在于鳞状上皮、导管上皮的基底细胞、肌上皮细胞和间皮细胞，腺上皮不表达用于鳞癌和腺癌别，间皮瘤和腺癌的鉴别导管上皮良恶性增生的鉴别34BE12（CKH）:高分子量细胞角蛋白，前列腺基底细胞标记，用于前列腺癌的诊断。CK19:40KD的角蛋白，在单层上皮和间皮中表达，在肝细胞不表达，用于鉴别肝细胞癌和胆管细胞癌；甲状腺肿瘤中，甲状腺乳头状癌常阳性表达，良性和其他癌很少表达。CK14：50KD的角蛋白，在复层上皮表达，是鳞状上皮的主要标记物。常用的CK抗体间叶组织的标记物–波形蛋白（vimentin，VIM）–肌组织标记物：Desmin（结蛋白）,actin（肌动蛋白）,myogenin（肌浆蛋白），MyoD1（肌调节蛋白）等–脉管标记：血管内内皮细胞的标记物：CD34,CD31,淋巴管D2-40–组织细胞的标记物：CD68,CD163,等–间皮细胞的标记物：calretinin，mesothelial等–用于鉴别软组织肿瘤的来源淋巴造血系统的标记淋巴造血组织，尤其淋巴细胞在其发育和分化过程中能形成许多分化性抗原，应用这些分化性抗原的特异性单克隆抗体能区分出免疫表型不同的细胞系，而且还能区分出同一细胞系的不同亚型和不同分化阶段的细胞群，因此可以利用此特性来诊断和分类恶性淋巴瘤和白血病。淋巴造血系统的标记•白细胞共同抗原（leucocytecommonantigen,LCA,CD45）•免疫球蛋白(immunoglobulinIg)•全B细胞标记物:CD20,CD79a,PAX5,Bob1等•全T细胞标记物：CD3,CD43,CD5,CD7,CD2等•T淋巴细胞亚群标记物：CD4,CD8•粒细胞和单核—巨噬细胞相关标记物:MPO,CD34,CD68等•浆细胞标记：CD38，CD138•其他：CD30,TDT,CD15，CD56，ALK，MUM1神经组织标记物•胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicproteinGFAP)•S-lOO蛋白(S—100Protein)•神经元特异性烯醇酶(NeuronSpecificEnolase，NSE)•髓磷脂碱性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)神经内分泌系统标记物NSE(NeuronSpecificEnolase,神经元特异性烯醇酶)CgA(chromograninA嗜铬颗粒蛋白A)Syn(synaptophysin突触囊泡蛋白)CD56器官或组织特异性抗原标记物前列腺标记物：PSA，PSAP，PSMA，P504s甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1甲状旁腺：PTH黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B，NapsinA肝细胞癌标记物：Hep-1乳腺：Mammaglobio，GCDFP15结肠：CDX2，B-catenin宫颈癌：P16病原体的标记•EBV•HPV•HBsAg和HBCAg•MCV与肿瘤预后相关的标记物Ki67：核阳性，与肿瘤增殖相关，细胞周期中除G0期细胞外，其余细胞均表达。肿瘤阳性细胞数越高，预后越差。P53：核阳性，肿瘤抑制基因，突变型P53蛋白稳定表达，P53蛋白阳性表明肿瘤预后差。nm23：胞浆阳性，抗转移基因，其表达降低与肿瘤的高转移能力，复发相关。与肿瘤多药耐药相关的标记物Her-2ERCC1PRM1BRCA1作用机制抗凋亡，参与调节P13K/AK途径和MAPK激活途径过表达使停滞在G2/M期的损伤DNA迅速恢复DNA修复的限速酶，吉西他滨的结合位点高表达使细胞修复能力增强阳性部位胞膜胞核胞浆胞浆/核判断标准≥++≥++≥++≥++耐药药物环磷酰胺三苯氧胺氨甲喋呤顺氯氨铂吉西他滨/顺铂顺铂与肿瘤多药耐药相关的标记物MDR1GSTπTSMDM2作用机制药泵作用解毒作用解毒作用转化作用阳性部位胞膜和浆胞浆胞浆胞浆判断标准≥++≥++≥++≥10%耐药药物恩环类紫衫类长春花碱（新碱）顺铂恩环类氮芥环磷酰胺5-FU多药耐药与肿瘤靶向药物有关的免疫标记物作用靶点肿瘤类型Tratugumab(赫赛汀）HER2乳腺癌和胃癌Cetuximab（艾比妥）EGFR结肠癌，非腺癌Bevacizumab（阿瓦斯汀）VEGF转移性大肠癌，肾癌Lmatinib（格列卫）C-Kit胃肠道间质瘤，慢粒Rituximab（美罗华）CD20淋巴瘤免疫组织化学在外科病理诊断中的应用免疫组织化学在外科病理诊断中的应用•恶性肿瘤性质?•癌组织的起源?•良性还是恶性?•肿瘤是原位还是侵袭性?•肿瘤分类?•癌的预后（包括分期）•决定治疗的靶向•其它方面……..未分化恶性肿瘤的性质?•最佳首选的抗体组合方案：–CK-pan（如MNF-116），或鸡尾酒调制的CK抗体（上皮性肿瘤）–LCA（淋巴瘤）–S100蛋白（恶性黑色素瘤，虽然一些癌会阳性表达）恶性肿瘤的性质LCACytokeratinS100淋巴瘤+*--癌-+-/+恶性黑色素瘤--+肉瘤--（有时+）-/+一些淋巴瘤LCA阴性表达,尤其是间变性大细胞性淋巴瘤和淋巴母细胞性淋巴瘤儿童小圆细胞肿瘤的性质•淋巴瘤/白血病:LCA+,CD99+/–•横纹肌肉瘤:Desmin+,MyoD1+,myogenin+•Ewing’肉瘤/PNET:CD99+,Syn–/+•神经母细胞瘤:CD99–,Syn+,NB84a+•促结缔组织生成性小细胞肿瘤:CK+,Desmin+,WT1+癌可能的起源•较常见的临床情况：–淋巴结或其它部位不明起源的转移癌–卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移–膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌–有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转移还是新的肺原发性肿瘤？不明起源癌的免疫组织化学应用器官特异性标记物•甲状腺：–Thyroglobulin（在~100%滤泡和乳头状癌+）–TTF-1–Calcitonin（在~90%髓样癌+）•前列腺:PSA•女性生殖道：CA125（黏液型常常阴性；间皮瘤和有时肺、乳腺及胰胆管腺癌会表达阳性）不明起源癌的免疫组织化学应用器官特异性标记物•肺：–TTF-1（80%腺癌阳性）•乳腺：BRST-2/GCDFP-15（50%病例阳性；但涎腺和汗腺也会阳性）•肝：HEP-1（~90%阳性）•肠：CDX-2（~100%一致性强阳性）•膀胱：Uroplakin（~50%阳性）应用特殊的CK抗体：不明起源的腺癌CK7和CK20都是非器官特异性标记物，但对腺癌的起源判断十分有用CK7CK20CK7+CK20+-女性生殖道黏液腺癌--一些胃癌--胰腺癌--胆管癌CK7+CK20–--各种腺癌--肺癌--乳腺癌--女性生殖道癌CK7–CK20+--胃肠腺癌CK7–CK20–--前列腺癌--肾细胞癌--肝细胞癌•举例：CK7和CK20联合应用：35岁女性，左颈淋巴结肿大，活检提示为转移性腺癌，CT扫描未发现原发灶，免疫组化标记显示肿瘤细胞表达CK7（-），CK20(+)，CDX2（+），提示结直肠来源，肠镜检查在横结肠发现12mm的病灶，活检证实为腺癌。不明起源的鳞癌或鳞样癌中的免疫组织化学应用•因为不同部位的鳞状细胞或鳞状细胞癌并不显示其独特的免疫表型，鉴别较困难•CD5：阳性支持胸腺起源•CK20：阳性提示为膀胱的移行细胞癌不明起源的小细胞癌中免疫组织化学的应用•CK20：Merkel’s细胞癌阳性表达•TTF-1：~90%肺小细胞癌阳性表达，但在肺外的小细胞癌也会阳性（~40%）卵巢腺癌：原发还是肠起源?卵巢起源肠起源CK7+–CK20–(但常会黏液腺癌阳性表达)+CDX-2–(但黏液型可以阳性)+膀胱活检腺癌：原发，前列腺还是结直肠起源?膀胱腺癌前列腺癌结直肠腺癌CK7+(65-80%)––CK20+(50-85%)–+PSA–+–CDX-2+(80%)–+β-catenin(细胞核)––+肺腺癌：原发还是结直肠起源?肺起源结直肠起源CK7+–CK20–+TTF-1+–CDX-2–+肿瘤良恶性鉴别•在以下一些情况形态学诊断困难：–在活检组织中挤压变形的细胞是癌细胞还是正常的淋巴细胞?–黏膜活检中藏有癌细胞吗?–增殖的细胞是良性增生还是恶性肿瘤?人为挤压的活检标本•有些活检（如支气管活检）显示人为挤压或烧灼（小细胞癌常见）：不能确认失常的细胞是否为癌细胞•若CK阳性的非正常上皮细胞存在于一定的部位（如间质）或以某种组织结构（如浸润性条索）存在则可诊断为癌•不需再次活检就可作出诊断鼻咽部活检：有没有癌?•对部分鼻咽癌（NPC）病例诊断较难，因为肿瘤细胞被大量的淋巴细胞和浆细胞所掩盖（淋巴上皮癌样）•CK-pan染色:仔细观察异常的阳性表现，如在完整的黏膜组织中有不规则的岛状、带状或单个分散的阳性细胞（正常仅表面及隐窝上皮细胞CK+）胃活检：是弥漫型癌?•胃活检可能有不易察觉的弥漫性癌；对印戒细胞癌和黏液细胞癌的鉴别可能困难•CK-pan染色：存在于固有膜中异常部位（正常没有CK+的细胞）和以异常结构（单个或索状细胞）存在的肿瘤细胞可被来辩认出来浆膜腔积液或活检：异常细胞是癌细胞还是反应性间皮细胞?•浆膜腔积液或活检中的一些异常细胞很难确定是癌细胞还是反应性间皮细胞•免疫组织化学的应用：–BerEP4或MOC-31：阳性倾向为癌–TTF-1：肺癌表达阳性–Calretinin：阳性倾向为间皮细胞反应性淋巴组织增生还是淋巴瘤?•诊断一个淋巴瘤须符合以下条件：–异常免疫结构–侵袭性/破坏性的依据–异常的免疫表型正常免疫结构（反应性淋巴组织：淋巴结或结外）B淋巴细