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实验10泡菜的腌制和亚硝酸的测定实验目的•1、尝试制作泡菜。•2、尝试用比色法测定泡菜中亚硝酸盐含量的变化。•3、讨论与此相关的食品安全问题。韩国泡菜相传是从我国传入的，堪称韩国“第一菜”。泡菜是一种以湿态发酵方式加工制成的浸制品，为泡酸菜类的一种。泡菜制作容易，成本低廉，营养卫生，风味可口，利于贮存。在我国四川、东北、湖南、湖北、河南、广东、广西等地民间均有自制泡菜的习惯。目前较受欢迎的是川味和韩味泡菜，在许多风味餐馆里，都有其踪影，它鲜嫩清脆，可以增进食欲，帮助消化与吸收。如果自己在家也做一些这样的泡菜，做为每天饭前小菜，或以它配菜，烹成各种菜肴，不失为一件美事。但是泡菜含亚硝酸盐具制癌作用危害身体健康，所以不宜多吃背景一、基础知识1、乳酸菌2）种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌1、乳酸菌1）结构：单细胞细菌3）生殖：二分裂在无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸。乳酸杆菌常用于制作酸奶。异养厌氧型C6H12O62C3H6O3酶+能量4）代谢：5）原理：思考：用乳酸杆菌制作酸奶时，牛奶的营养和能量会发怎样的变化？为什么？把100毫升的牛奶分别放入100、200、300、400毫升的容器中进行乳酸发酵，最先发酵成功的是哪个？你能说出理由吗？100毫升的容器，因为乳酸菌是严格的厌氧呼吸，在100毫升容器中，空气最少，能造成严格的无氧环境。6）分布乳酸菌种类很多，在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有乳酸菌的分布。你能说出乳酸杆菌/酵母菌/醋酸杆菌的异同吗?•为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不吃存放时间过长、变质的蔬菜？•答：有些蔬菜，如小白菜和萝卜等，含有丰富的硝酸盐。当这些蔬菜放置过久发生变质（发黄、腐烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。为什么含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶？因为酸奶的制作依靠的是乳酸菌的发酵作用。抗生素能够杀死或抑制乳酸菌的生长，因此含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶。1）性质：2）作用：为白色粉末，易溶于水。食品添加剂2、亚硝酸盐一般不危害健康总量达0.3～0.5g时会中毒，达3g时会死亡3）影响：4)分布：蔬菜中亚硝酸盐的平均含量约为4mg/Kg，咸菜中亚硝酸盐的平均含量在7mg/Kg以上，豆粉中平均含量可达10mg/Kg。5)卫生标准：亚硝酸盐的残留量在肉制品中不得超过30mg/Kg酱腌菜中不超过20mg/Kg婴儿奶粉中不得超过2mg/Kg。在什么情况下，亚硝酸盐会转化为亚硝胺？亚硝胺有何危害？适宜的pH、温度和一定的微生物作用动物实验表明，亚硝胺具有致癌作用，对动物具有致畸和致突变作用。人类的某些癌症与亚硝胺有关。实验设计•泡菜制作过程要点：•水盐比例•香辛料•如何保证无氧环境？修整、洗涤晾晒、切分原料加工条状或片状加盐盐水冷却泡菜盐水加入调味料并装坛发酵成品测亚硝酸含量•泡菜制作：①将新鲜蔬菜预先处理成条状或片状。②泡菜盐水按清水和盐为4∶1质量比配制煮沸冷却备用。③预处理的新鲜蔬菜装至半坛时放入蒜瓣、生姜、香辛料等佐料，并继续装至八成满。④倒入配制好的盐水，使盐水浸没全部菜料。⑤盖上泡菜坛盖子，并用水密封发酵。发酵时间受到温度影响。腌制条件时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量不足10％、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。一般在腌制10天后，亚硝酸盐的含量开始下降。温度：28-32摄氏度乳酸菌繁殖的最适温度4、泡菜坛的选择泡菜坛本身质地好坏对泡菜与泡菜盐水有直接影响，故用于泡菜的坛子应经严格检验，其优劣的区分方法如下：①观型体:泡菜坛以火候老、釉质好、无裂纹、无砂眼、形体美观的为佳。②看内壁:将坛压在水内，看内壁，以无砂眼、无裂纹、无渗水现象的为佳。③视吸水:坛沿掺入清水一半，用废纸一卷，点燃后放坛内，盖上坛盖，能把沿内水吸干（从坛沿吸入坛盖内壁）的泡菜坛质量较好，反之则差。④听声音:用手击坛，听其声，钢音的质量则好，空响、砂响、音破的质次。火候好无裂纹、无砂眼坛沿深、盖子吻合好（2）添加的调味品，如花椒、八角等。（3）白酒。（4）食糖和盐。材料（1）各种蔬菜均可，一般用白菜、洋白菜、黄瓜、柿子椒、胡萝卜、白萝卜等。实验步骤（1）各种菜洗净并切成3～4cm长的小块。（2）将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。（3）将各种蔬菜、盐水、糖及调味品放入坛，混合均匀。如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1分钟后入坛，再加上一些白酒。（4）将坛口用水封好，防止外界空气进入。（5）泡菜发酵（6）如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于接种已经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物，主要是以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。发酵产物中除乳酸外，还有其他，如乙醇、CO2等称异型乳酸发酵发酵前期：此时泡菜液的含酸量约为0.3%～0.4%，是泡菜初熟阶段，其菜质咸而不酸、有生硝酸还原菌将蔬菜中的硝酸盐还原成亚硝酸盐，硝酸盐含量上升由于前期乳酸的积累，pH值下降，嫌气状态的形成，乳酸杆菌进行活跃的同型乳酸发酵，乳酸的积累量可达到0.6%～0.8%；乳酸积累pH达到3.5~3.8.大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为完全成熟阶段，泡菜有酸味且清香品质最好。发酵产物中只有乳酸，称为同型乳酸发酵发酵中期：发酵产物乳酸增加，硝酸还原菌受到抑制，产生的亚硝酸盐被分解，亚酸盐含量开始下降！在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继续增加，可达1.0%以上。当乳酸积累达1.2％以上时，乳酸杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。发酵后期：此阶段泡菜酸度过高、风味不协调。此阶段泡菜硝酸菌完全抑制。从乳酸的含量、泡菜的风味品质来看，在初期发酵的末期和中期发酵阶段，泡菜的乳酸含量为0.4%～0.8%，风味品质最好，因此，常以这个阶段作为泡菜的成熟期。腌制1周左右即可开坛食用。也可随时加入新鲜蔬菜，不断取用。成品1、加入白酒有什么作用？白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，它也是一种调味剂，可增加醇香感。几个思考题：2、用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么结果？水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，空气中21％是氧气，这是最简易的造成无氧环境的方法。这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂。说出坛内微生物的代谢类型的变化情况。3、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这层白膜是怎么形成的？形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。4、为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不吃存放时间过长、变质的蔬菜？有些蔬菜，如小白菜和萝卜等含有丰富的硝酸盐。当这些蔬菜放置过久时发生变质（发黄、腐烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。这些蔬菜究竟能不能吃，你判断的理由是什么？二、亚硝酸盐含量的测定测定亚硝酸盐含量的原理在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，再与N-1－萘基乙二胺盐酸盐结合生成玫瑰红溶液。将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量。我们还学过哪些颜色反应？亚硝酸钠标准显色液浓度越高，颜色越深2、材料与器具泡菜、对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺盐酸盐、亚硝酸钠、氯化镉、氯化钡、氢氧化钠、氢氧化铝、蒸馏水、榨汁机、移液管、容量瓶、比色管等（3）、测定亚硝酸盐含量的操作1）配置溶液对氨基苯磺酸溶液：称取0.4克对氨基苯磺酸，溶解于100ml体积分数为20％的盐酸中，避光保存(4mg/ml)。N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液：称取0.2克N-1－萘基乙二胺盐酸盐，溶解于100ml的水中，避光保存(2mg/ml)。亚硝酸钠溶液：称取0.10克于硅胶干燥器中干燥24小时的亚硝酸钠，用水溶解至500ml，再转移5ml溶液至200ml容量瓶，定容至200ml(5ug/ml)2）制备标准显色液用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml亚硝酸钠溶液，分别置于50ml比色管中，再取1支比色管作为空白对照。并分别加入2.0ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5分钟后，再分别加入1.0mlN-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馏水至50ml，混匀，观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化。提取剂：分别称取50克氯化镉、氯化钡，溶解于1000ml蒸馏水中，用盐酸调节pH至1。氢氧化铝乳液和2.5mol/l的氢氧化钠溶液。作用：增大亚硝酸钠的溶解度作用：作吸附剂，充分使滤液脱色中和过多盐酸，营造碱性环境亚硝酸钠溶液对氨基苯磺酸溶液N-1-萘基乙二胺盐酸盐3～5分钟静置2）配制标准显色液的基本步骤是样品处理液的制备3）制备样品处理液的步骤是：①称取0.4kg泡菜，粉碎榨汁，过滤得约200mL汁液。②取100mL汁液倒入500mL容量瓶，添加200mL蒸馏水和100mL提取剂，摇床振荡1h，再加40mL氢氧化钠溶液，最后用蒸馏水定容到500mL并立刻过滤获得滤液。③将滤液60mL移入100mL容量瓶，用氢氧化铝乳液（吸附脱色）定容后过滤，获得无色透明的滤液。取泡菜榨汁过滤汁液蒸馏水加氢氧化钠定容氢氧化铝乳液定容+（4）比色的步骤是：①将40mL滤液移入50mL比色管中，并编号。②分别依次加入2.0mL的对氨基苯磺酸溶液和1.0mL的N-1-萘基乙二胺盐酸溶液，并定容到50mL，混匀静置15min。③观察颜色变化，并与标准显色液比较，记录亚硝酸盐含量。④计算样品滤液（40mL）中亚硝酸盐含量。计算公式是：样品中亚硝酸盐含量（mg）取样量（40mL滤液的质量，Kg）（4）比色吸取40ml透明澄清的滤液，转移到50ml比色管中，将比色管做好标记。按步骤2的方法分别加入对氨基苯磺酸溶液和N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液，并定容至50ml，混匀，静置15分钟后，观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，找出与标准液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量，并计算。每隔2天测一次，将结果记录下来。封坛前封坛后4天封坛后8天封坛后12天封坛后15天0.150.600.200.100.101号坛2号坛0.150.200.100.050.053号坛0.150.800.600.200.20泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量的变化4、实验结果……三只泡菜坛中的亚硝酸盐含量变化的绝对数量虽然不同，但整体的变化趋势却基本相同。在腌制后的第五天，三只泡菜坛中亚硝酸盐的含量都达到最高峰前6天内，亚硝酸盐含量就可以达到最高峰。第9天后，亚硝酸盐含量开始有明显下降。原因：由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌），这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作，使其生长繁殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。亚硝酸盐含量发酵时间（d）（1）亚硝酸盐含量在第6天达到最高峰。（2）亚硝酸盐含量升高的原因是蔬菜组织和细菌内的硝酸还原菌的活动增强，将硝酸盐还原为亚硝酸。（3）亚硝酸盐含量降低的原因是蔬菜组织和细菌内的硝酸还原菌受到抑制，同时形成的亚硝酸盐又被分解，因而亚硝酸盐含量下降还原减少在腌制后的前6天内，泡菜中的亚硝酸盐含量就可以达到最高峰。而第9天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降。这可能是由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌），这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作，使其生长繁殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。均样+水→捣碎→加果蔬提取剂（50gBaCl2+CdCl2→加1000ml重蒸馏水中，用浓HCl调PH为1）→振荡1小时→用NaOH调至中性→定容→过滤→滤液应无色透明•课题成果评价•（一）泡菜腌制的