9.色谱法概论(09药)

第9章色谱法概论（Chromatographygenerality）9-1色谱法的起源、历程及分类9-2色谱过程与术语干扰的消除控制实验条件使用掩蔽剂分离separation化学分析方法的基本要求是什么？准确！快速！灵敏！选择性20世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：化学沉淀、电解沉积、重结晶、蒸馏、溶剂萃取和离心。现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。用途：色谱法已广泛用于各个领域，是多组分混合物首选的分离分析方法。以《中国药典》2005版为例，一部收载中药1146个品种，用薄层色谱进行鉴别或含量测定的有1523项，用高效液相色谱进行定量分析的有479种518项，用气相色谱进行检测的有47种。二部收载的有1967个品种，采用高效液相色谱法的品种有848种。现在色谱法已形成一门专门的科学。9-1色谱法的起源、历程及分类一、色谱法的起源1903年3月21日俄国植物学家茨维特MichaelTswett（1872-1919）在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种吸附现象在分离分析方面有重大价值。1903年，Tsweet应用色谱分离现象碳酸钙（固定相）色素混合液石油醚(流动相）色谱柱色带植物色素分离图示重现石油醚色谱色：颜色谱：图谱19061906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法。1907年在德国生物学会年会上，展示过带有色带的分离柱管和纯化过的植物色素溶液。茨维特被世人公认为色谱创始人。ChromatographyMichaelTswett希腊语中“chroma”=color;“graphein”=write二、色谱法的历程1931年kuhn（库恩）分离60多种胡萝卜素；1935年Adams和Holmes第一次用苯酚和甲醛合成了人工有机离子交换剂，能交换阳离子和有机氢离子。后来又合成了阴离子交换剂，既可用于离子交换，又用于色谱分离——即现时流行的离子交换色谱法。至1950年此方法已成型。1938年：Izmailov等人将糊状Al2O3浆液在玻璃板上铺成均匀薄层，用于分离植物中的药用成分，即今日用的薄层色谱。（用于薄层的材料已发展至多种：如硅胶、聚酰胺等）。1941年：Martin和Synge设计了两套萃取仪器，将蛋白质水解产物的乙酰化氨基酸由水溶液中提取到有机相而进行色谱分离。不久又研究了颗粒硅胶柱中三种衍生化氨基酸混合物在水相和有机相（氯仿）之间的不等分配，获得成功，使三个组分得到良好的分离。这一成功为液－液分配色谱奠定了基础。他们还提出气相色谱的设想。1944年：Consden，Gordon和Martin将纤维（滤纸）作固定载体，以水吸附在滤纸上作溶剂，根据组分在两相中溶解度不同，即渗透率（速率）不同而使各组分彼此分离，称之为纸色谱法。1952年：Martin和Synge又研究成功了在惰性载体表面涂渍一层均匀的有机化合物膜作为固定相，并以气体为流动相，用来分离脂肪酸混合物——即今日的气－液色谱。1937-1972年，15年中有12个Nobel奖是有关色谱研究的！1954年Ray提出以热导池作为气相色谱的检测器，使气相色谱的应用更加广泛。1955年第一台商品GC问世；标志现代色谱分析的建立。1957年：Golay首先应用小口径毛细管柱进行色谱分离实验，结果证明了它具有高分辨率和高效能——即为今日的高效毛细管气相色谱法。1959年：Porath和Flodin提出了使用具有化学惰性的多孔凝胶作固定相的空间排阻色谱法，根据固定相孔隙尺寸不同而具有不同的选择性渗透能力，从而对分子量分布不同的样品实现了分离。可用于测定聚合物的相对分子质量的的分布。60年代末，出现了HPLC；80年代，超临界流体色谱；Jorgeson发展了毛细管电泳90年代后期毛细管电色谱21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱。我国在色谱分析领域的研究起于1954年，由中国科学院大连化学物理研究所首先开发。经过几十年的努力，我国色谱基础理论研究和应用技术研究方面具有特色，居世界领先行列。色谱法是什么样的方法呢？经典的分离方法如1.沉淀法：利用物质溶解度的不同而进行分离。2.蒸馏法：利用有机物沸点的差异进行分离。3.萃取法：利用组分在水相和有机相（互不相溶）中的分配系数不同进行而分离。定义：利用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行反复多次的分配来达到分离的目的。色谱法原理：色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法。固定相：不动的一相流动相：携带样品流过固定相的流动体色谱法共同的基本特点（1）具备两个相当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。（2）分配系数色谱法的特点优点：“三高”、“一快”、“一广”缺点：高选择性、高效能、高灵敏度、分析速度快、应用范围广•有效分离的量少•对未知物分析的定性专属性差三、色谱法的分类分类1流动相气相色谱液相色谱气体液体超临界填充柱色谱毛细管色谱分配色谱离子色谱空间排阻分离植物色素液固吸附色谱1.按两相状态分类2.按分离机理分类3.按操作形式分类纸色谱法（PC）平面色谱薄层色谱法（TLC）LLCLCLSC柱色谱法SECSFCIECBPCGSCGC—柱色谱法GLC色谱法的现状和发展趋势现状：理论、技术和方法趋于成熟发展：新型固定相和检测器的研制色谱新方法的研究色谱联用技术色谱专家系统9-2色谱过程与术语一、色谱过程二、色谱图工业二甲苯中的杂质分析色谱流出曲线和色谱峰基线在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线噪音漂移色谱峰流出曲线上突起的部分正常峰（对称）前沿峰非正常峰拖尾峰ABAAWfhs2)(205.0——fs在0.95~1.05之间——fs小于0.95——fs大于1.05不对称因子1.保留时间tR试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间。它是色谱法的基本定性参数。保留值（峰位）分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间。2.死时间tM(t0)因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近．测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算。mtLu某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时间3．调整保留时间tR′即某组份的保留时间扣除死时间tR′=tR—tM由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR′实际上是组份在固定相中停留的总时间．保留时间可用时间单位（如s）或距离单位（如cm）表示。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定．4．保留体积VR从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间tR的关系如下：VR=tR·F0因为流动相流速大，保留时间短，但两者的乘积不变，因此VR与流动相流速无关。色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及进样器和检测器的空间的总和．当后叁项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速Fc（mL／min）计算：VM=tM·Fc5．死体积VM某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即VR′=VR-VM6．调整保留体积VR′7．相对保留值γi,s由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是GC中，广泛使用的定性参数。必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比。某组份i的调整保留值与基准物质S的调整保留值之比，称为相对保留值：sisiRsRiRsRikkKKVVttsir,12121212kkKKVVttRRRR8．选择性因子混合物中组分2与组分1的调整保留时间之比色谱峰高和峰面积（定量参数）1.峰高h：指组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离2.峰面积A：指色谱曲线与基线间包围的面积区域宽度色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：1.标准偏差σ正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即正常峰0.607倍峰高处峰宽的一半。σ的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。2.半峰宽W1/2即峰高一半处对应的峰宽，它与标准偏差σ的关系是：W1/2=2.355σ3.峰宽W即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，它与标准偏差的关系是：W=4σ或W=1.699W1/2从色谱图上，可以得到许多重要信息：（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数．（2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析．(3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析．（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据．（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据．1．分配系数K如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附-脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即msCCK溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度分配系数与色谱分离2.分配比k分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即msnn量组分在流动相中物质的量组分在固定相中物质的k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。K值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在空间排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。mmssmsVCVCnnk3.分配系数K与容量因子k的关系其中β称为相比（率），它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6～35；对毛细管柱，其β值为60～600。kVVkVnVnCCKsmmmssms//分配系数和容量因子与保留时间的关系分配比k值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以u＞us。此两速度之比称为保留比Rs。rmssttuuRRs若用质量分数表示，即对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为knnnnnRmssmms1111sruLtuLtm整理上面的式子，可得色谱保留方程：)1(kttmrmrmrmmrVVtttttk色谱分离的前提根据色谱保留方程，对A、B两组分的分配系数比，用下式表示)()()()()()(AKBKAkBkAtBtrr上式表明：通过分配系数比α把实验测量值k与分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则α=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。选择1.反映色谱柱柱型及其结构特性的参数是（）。A.分配比B.保留值C.分配系数D.相比2.色谱分离过程中，固定相对物质