组织培养

第三章植物组织与器官培养第一节植物组织培养植物组织培养（组培planttissueculture）指将植物组织在适当培养条件下诱导长成完整植株的技术试管植物（Vitroplant）植物组织培养再生的植物细胞全能性（totipotency）---植物组织培养技术的重要理论基础---在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植株。分化程度越高，全能性越低植物脱毒(viruselimination)利用植物组织培养技术,脱除植物细胞中侵染的病毒,生产健康的繁殖材料的技术.快(速)繁(殖)利用细胞的再生特性,在组织培养条件下加速繁殖材料的个体生产,提高繁殖系数的技术重点与难点：1.植物组培再生植株的发生途径2.植物组培的基本过程一.植物组培发展历史：1934—1948植物生长素被发现1956激动素1958Steward从胡萝卜根愈伤组织获得单细胞，诱导成胚再生成植株。20C60s植物组培规模化应用“兰花工业”种子萌发时先是胚的膨大,种皮破裂,40天时肉眼可见浅黄色的原胚呈球状,称为原球茎1960年法国的Morel观察到虎头兰的茎尖在无菌的培养基上能够形成扁圆形的小球体，这些小球体与幼胚发育成的原球体非常相似，故称为原球茎.在一定条件下，这些原球茎通过切割能够快速增殖，并能够再生成完整植株---兰花试管苗“工业”，简称“兰花工业”。二.植物组培再生植株的发生途径两条：器官发生途径体细胞胚发生途径1.器官发生途径1.1基本概念1）器官发生指离题培养的组织或细胞团分化形成不定根、不定芽等器官的过程不定根（adventitiousroot）指植物的茎或叶上所发生的根。它不是直接或间接由胚根所形成的，没有固定的生长部位，它不按正常时序发生。有扩大植物吸收面积和增强固着或支持植物的功能。不定芽在高等植物正常的个体发育中，芽一般是只从茎尖或叶腋等的一定位置生出。所以这种象顶芽、腋芽、副芽等均在一定部位生出的芽，称为定芽．与此相反，凡从叶、根、或茎节间或是离体培养的愈伤组织上等通常不形成芽的部位生出的芽，则统称为不定芽。紫背天葵2）.愈伤组织（Callus）脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织结构、无明显极性的松散细胞团3）.外植体（explant）植物体上切取下来进行培养的部分组织或器官魔芋的愈伤组织菠萝的愈伤组织草莓的愈伤组织水稻的愈伤组织发育成幼苗1.2器官发生步骤1）.启动期诱导外植体细胞脱分化和分裂2）.愈伤组织诱导诱导脱分化细胞形成愈伤组织3）.拟分生组织的形成（meristemoid）在植物组织培养中，不是所有的培养细胞都同样分裂增殖，常常是细胞群中的一部分细胞进行旺盛的分裂形成细胞块，此称为拟分生组织。这里指的是只具有分生能力的细胞。4）.器官原基和器官的形成器官原基：胚胎发育中能辨认出的将来发育为某器官的部分。器官发生：先芽后根、先根后芽、根芽同生体细胞胚（somaticembryo）又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。胚的发育图2.体细胞胚发生途径什么是体细胞胚香蕉心形体细胞胚(A)伸长期合子；(B)合子经过第一次分裂,产生1个顶细胞(绿色)和一个基细胞(粉红色)；(C)四分体胚:顶细胞经历2次纵向分裂，产生含有4个细胞的胚体和2个细胞的胚柄；(D)16细胞球形胚:8细胞胚的所有细胞经过1次平周分裂,产生包含8个细胞的表皮原和8个细胞的内部组织；(E)早期心形胚；(F)心形胚:子叶和胚根原基已经出现；(G)成熟胚胎。1:顶细胞;2:基细胞;3:胚根原细胞,形成未来的ROC和根冠中央区;RM:根尖生长点;SM:茎尖生长点双子叶植物的胚胎发育过程2.1体细胞胚胎发生的方式植物组织培养过程中植物体细胞胚胎途径可归纳为两类：直接途径和间接途径。直接途径是直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成间接方式是体胚从愈伤组织或悬浮细胞（包括原生质体）、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成，如香雪兰（Freesiarefracta）花序外植体经直接体细胞胚胎发生途径形成再生植株。花粉培养单细胞悬浮培养原生质体培养组织器官培养体细胞胚花粉胚非合子胚非合子细胞合子胚无融合生殖胚大量研究表明，大多数植物组织培养，单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生（pollenembryogenesis）前者为二倍体的体细胞产生的胚状结构后者是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，通常称花粉胚（pollenembryos），可发育成单倍体植株。体细胞胚的产生三.植物组织培养的基本过程1).培养材料的选择与采集2).培养材料的预处理3).制备外植体[诱导愈伤组织悬浮培养诱导胚性组织]4).接种和培养5).根的诱导6).炼苗移栽1外植体的选择基本要求：生长正常、无病虫害.从中选择适宜的组织器官。外植体的选择因获得植物细胞的处理方法而异.1）.直接分离选择细胞之间粘连程度较小的植物组织/器官最好：叶片2）.愈伤组织的诱导不同植物种类及同一植物的不同器官对于诱导条件的反应是不同的。（1）.种类百合科风信子较易诱导和再生小植株而同属百合科的郁金香则较困难（2）.基因型百合花（100多种:亚洲百合、麝香百合、香水百合、火百合、姬百合等），以花药为外植体时，亚洲杂交种系的诱导率大于麝香杂种系亚洲百合麝香百合（3）.取材部位紫草根、茎、叶都可，以根为好百合外层鳞片芦荟幼嫩侧芽当归根叶柄（4）.外植体的生理状态拟石莲花叶：嫩叶仅产生根老叶芽中等根、芽人参根（多年生根）（5）.取材季节紫草秋天银杏早春（6）.外植体大小0.5×0.3×0.2㎝3易产生Callus大蒜蒜瓣0.2×0.2×0.1㎝3较少/不产生3）.分离原生质体（Protoplast）多数植物：苗龄、叶龄与原生质体的产率和存活率有很大关系。eg：花生叶：苗龄15～20d，刚平展开的幼叶是游离叶肉原生质体的最佳材料。2外植体的预处理2.1消毒从植物体上获取外植体后，要先用自来水冲洗10min[表面不光滑的，需冲洗1～2h，可用洗衣粉/洗洁精清洗，必要时可用毛刷]滤纸吸干水分消毒[可先在70%的酒精溶液中浸泡30s]1）.常用的消毒剂消毒剂用法&用量处理时间优缺点漂白粉饱和液取上清10～30min杀菌效果好，对植物组织伤害较轻，易清洗酒精70～75%15～30s适合表面消毒，杀菌不彻底，常和其他消毒剂联合使用H2O26～12%------效果很好，易清洗，不损伤外植体，较适合叶片组织的消毒升汞（HgCl2）0.1～0.2%------效果很好，难去除NaClO32～10%5～30min效果很好，易去除，且对组织无害2）.消毒方法（1）.茎尖、茎段、叶片自来水75%酒精10～30s无菌水冲洗2～3次2～10%NaClO310～15min0.1～0.2%HgCl25～10min无菌水冲洗4～5次无菌滤纸吸干切割（2）.果实、种子自来水75%酒精果实：2%NaClO310min无菌水清洗数次剖出种子或组织种子：NaClO320—30min～几小时视种皮的硬度而定，种皮太硬的，先去种皮，再用4～8NaClO38～10min（3）.根及地下贮藏器官自来水毛刷刷洗滤纸吸干纯酒精漂洗0.1～0.2%HgCl25～10min2%NaClO310～15min无菌水洗涤3～4次（4）.花药花药(anther)是花丝顶端膨大呈囊状的部分，是雄蕊产生花粉的主要部分。大多数被子植物的花药是由4个花粉囊（pollensac）（少数植物为2个）组成，分为左、右两半，中间由药隔相连。在成熟的花药中，同侧的两个花粉囊之间的分隔被打破，形成一室，使4个花粉囊的花药现出两个花粉囊的样子处于花萼、花瓣、颖片的严密包围之中，通常无菌，一般只需对整个花蕾或幼穗杀菌、消毒即可。70%酒精擦拭漂白粉上清液10min无菌水2～3次3.其他预处理1）.预培养（1）.可减轻醌类物质对培养物的毒害作用植物组织经切割或剪切后，细胞中的酚类物质在酚酶的作用下，与空气中的氧化合，产生大量的醌类物质，新生的醌类物质能使植物细胞迅速变成褐色，这种变化称为酶促褐变，简称褐变。褐变饲料加工过程中或长期贮存于湿热环境下，其所含的氨基化合物如蛋白质、氨基酸及醛、酮等与还原糖相遇，经过一系列反应生成褐色聚合物的现象称为褐变反应（非酶促褐变），简称褐变。山月桂树茎尖：接种在固体Medium上12～24h后转入液体Medium，每天1次，持续1周，无褐变现象。（2）.调整材料生理状态可使幼叶具有良好的生理状态，进而提高原生质体的形成率。eg：桑叶经预培养后，原生质体形成率可提高至原来的12.9倍2）.黑暗处理对外植体愈伤组织诱导效果影响很大花梗黑暗处理7d诱导率85.7%甘蔗黑暗处理12h较易分离原生质体3）.低温/高温处理春小麦穗4℃3～6d低温提高出愈率接种后花药6～9d高出2～4倍番茄叶原生质体分离前4℃8h可大大提高P（3～4周龄）的形成率4）.萎蔫处理日光、灯光下萎蔫2～3h，易于撕下表皮，有利于E解。5）.抗氧化剂处理eg：①.花生叶肉细胞/原生质体中添加Vc可增加SOD活性，降低E解过程中对原生质体的损伤。②.核桃：茎尖、嫩茎2.0%Na2S2O3,20～30min消毒0.2%Na2S2O3可提高Callus的诱导效果。6）.高渗透压处理可保持原生质体的完整性，减轻原生质体分离时的聚集和自发融合，提高原生质体的形成率与存活率。叶肉原生质体培养：培养基：MS＋NAA2.0ppm＋BA0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇一般：蔗糖：10%～20%KCl0.4～0.8mol/L甘露醇：0.4～0.6mol/L山梨醇：0.8～1.2mol/L四.植物组培的培养基1）.组成①.激素生长素：IAA、NAA、2，4-D、IBA分裂素：KT6-BA玉米素用量：0.1～10mg/L②.无机盐总浓度25mmol/L左右NO3-25～40mmol/LK+（必须）20mmol/L↗P、S、CaMg1～3mmol/L③.C源蔗糖/G④.有机N源Pr水解产物、Gln、AA混合物⑤.有机酸：丙酮酸、TCA：柠檬酸、琥珀酸、苹果酸⑥.复合物生长调节剂酵母抽提液、椰子汁常用Medium：MS、B5、N62）.培养基的准备①.无机盐、C、Vitamin、激素：需高纯度，使用前需重结晶，酒精-水溶液需脱色②.水：蒸馏水、高纯度去离子水③.pH：0.5MHCl/0.2MNaOH调节④.Agar：0.6～1.0%（固体Medium）⑤.灭菌：一般120℃15～20min含热原的：过滤⑥.用法：把液体M配制成10倍/100倍母液，用时稀释，稀释后10℃保藏；其中：CaCl2、KI、EDTA单独配制，用时再稀释混合。