搜索
第二章含6×His标签T7Select10-3b载体的构建2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1实验材料及试剂宿主菌E.coliBLT5615Novagen公司T7Select10-3b噬菌体Novagen公司EcoRI/HindIIIEndModificationKitNovagen公司DNALigationKitNovagen公司T7Select10-3bCloningKitNovagen公司DNaseITaKaRa公司β-AgaraseTaKaRa公司TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitTaKaRa公司2000bpDNALadderTaKaRa公司TaqDNA聚合酶TaKaRa公司IPTGAMRESCO公司DNA纯化试剂盒庄盟公司其他常用试剂：羧苄青霉素(Carb)、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、胰蛋白胨、酵母菌粉、琼脂、琼脂糖、NaCl、甘油、PEG8000等为进口分装或国产分析纯。引物合成与测序由北京宝瑞通生物科技有限公司完成。2.1.1.3主要试剂配制LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母菌粉5g/L，NaCl10g/L，pH7.0LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母菌粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，pH7.0LB半固体培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母菌粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，pH7.050mg/ml羧苄青霉素溶液:Amp1g溶解于10mL蒸馏水中，过滤除菌，-20℃保存。噬菌体提取缓冲液：20mMTrisHCl，pH8.0，100mMNaCl，6mMMgSO450×TAE电泳缓冲液:Tris24.2g，冰醋酸5.7mL,0.25mo1/LEDTA(pH8.0)20m1，加蒸馏水至100mL，室温保存，使用时用双蒸水稀释至1×工作浓度。1%琼脂糖凝胶：琼脂糖1g，加入100mL0.5×TBE溶液。2.1.1.4主要实验仪器分析天平上海民桥精密科学仪器有限公司，FA1104NPH计上海任氏电子有限公司，6173PCR仪WhatmanBiometra，T-Gradient电泳仪北京六一仪器厂自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂，SZ-93紫外/可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司，TU-1810生物洁净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司，BCN-1360B手掌型离心机海门市麒麟医用仪器厂，Lx-100高速冷冻离心机sigma，2-16K液氮容器乐山市东亚机电工贸有限公司电热恒温水浴锅北京市永明医疗仪器厂，DZKW-D-2电热恒温干燥箱黄石市医疗器械厂，72-1隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械一厂，PYX-DHSFluor-S凝胶成像系统美国Bio-Rad公司超低温冰箱海尔公司，-86℃ZKU-L200Eppendorf管若干（1.5ml、50ml），移液枪枪头若干（10μL-1000μL）2.1.2方法2.1.2.1T7Select10-3b宿主菌的培养T7Select10-3b噬菌体的合适宿主菌株为E.coliBLT5615，加甘油存于-80℃中。2.1.2.1.1初代培养向20mL无菌LB液体培养基中加入20μL50mg/mLcarb，摇匀后接入200μLBLT5615，用含有20μL50mg/mLcarb的20mL无菌LB液体培养基做空白对照。于37℃，220rpm摇床过夜培养。2.1.2.1.2继代培养1）向300mL无菌LB液体培养基中依次加入300μL50mg/mLcarb和2mL过夜培养的菌液。用只含有20μL50mg/mLcarb的20mLLB培养基做空白对照。于37℃，220rpm摇床培养。2）约1.5h后，以空白培养基为对照测量菌液600nm波长下的吸光度，直到OD600值达到0.5。加IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续摇床培养30min，得宿主菌悬液（最终OD600至0.6-1）。2.1.2.2T7噬菌体的扩增1）向培养好的宿主菌悬液中加入100μLT7Select10-3b噬菌体原液。继续37℃，220rpm摇床培养，使宿主细胞裂解。用不加T7噬菌体原液的宿主菌液做空白对照。约1.5h后宿主细胞裂解，瓶内产生丝状沉淀。3-4h，丝状物增多，溶液比以前澄清，裂解完毕。2）向裂解液中加入12μL5mg/mLDNaseI，37℃摇床培养15min。3）加入7.5gNaCl固体，充分振荡溶解。分装于50ml离心管中，4℃10000rpm，离心10min。4）取上清至无菌三角瓶中，加入30gPEG8000，使其充分溶解，4℃过夜储存。6）将混合液分装至24个1.5mL离心管中，4℃10000rpm离心10min。去除上清，将离心管倒扣在吸水纸上，使干燥沉淀。8）每管加入150μL1MNaCl,10mMTris-HCl(pH8.0),1mMEDTA的缓冲液，剧烈震荡，使沉淀溶解。2.1.2.3T7噬菌体DNA的提取1）将上述溶解液分装到1.5mL离心管中，每管加入等体积的Tris-饱和酚，颠倒混匀，4℃10000rpm离心10min。取上层液相，再用等体积的Tris-饱和酚抽提两次。3）取上层液相，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），颠倒混匀，4℃10000rpm离心10min。重复1次。4）取上层液相，加入等体积的异丙醇，4℃静置2h。4℃12000rpm离心5min。去除上清，将离心管倒扣在吸水纸上，干燥沉淀。6）加入0.5mL70%乙醇，颠倒清洗沉淀，4℃12000rpm离心5min，去除上清。重复1次。7）将沉淀干燥后，每管加入400μL无菌双蒸水，室温静置使DNA溶解。用ND2000测OD260/OD280及OD260/OD230值。另取5μLDNA溶液用0.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。2.1.2.4T7噬菌体DNA的双酶切及鉴定酶切反应体系T7DNA20μL（≤20μg）10×MBuffer40μLXhoI20μLSacI20μLddH2O300μLtotal400μL37℃酶切4h，65℃热激10min。取5μL酶切产物经0.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。2.1.2.5T7载体臂的回收将酶切产物进行0.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳后，按照TaKaRaβ-Agarase说明书进行T7DNA载体臂的回收。具体步骤如下：1）用纸巾吸干凝胶表面液体，在紫外灯下切出含有目的DNA片段的凝胶。将凝胶切成细块后移入已称重的EP中计算重量。2）按照1mg=1μL计算凝胶体积，向胶块中加入1/10凝胶体积的10×β-AgaraseBuffer平衡体系。65℃加热10min使琼脂糖融化，冷却至60℃后静置平衡5min。3）加入β-Agarase60℃消化1h，每200mg（约200ul）0.5%的凝胶加1U（1ul）β-Agarase。4）冰上放置15min，12000rpm4℃离心15min。取上清液，加入盐溶液使其终浓度为：2.0MCH3COONH4；0.15MNaCl；0.3MCH3COONa。5）加入等体积异丙醇，充分混匀后-20℃冷却60min，12000rpm离心15min。6）去除上清，用70%乙醇洗沉淀2次。7）将沉淀干燥后，加少量无菌ddH2O室温静置溶解。用ND2000测OD260/OD280及OD260/OD230值，-20℃保存备用。2.1.2.6含6×His插入标签的制备1）引物设计与合成根据T7Select10-3b噬菌体的DNA序列，应用Primer5.0软件设计引物①、②，将6×His标签设计到上游引物中。在上游引物及下游引物的5’端分别加入SacI及XhoI酶切位点。1）1）1）1）1）1）1）1）第二章吸烟者肺癌组织T7噬菌体cDNA文库构建2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1组织临床资料3例吸烟者肺癌组织由河北医科大学第四医院提供，均为男性吸烟患者，处于III、IV期，患者术前均未进行化疗、放疗，样本取出后立即置于RNALater中，-20℃保存。2.1.1.2主要生化试剂及试剂盒RNeasyMiniKitQIAGEN公司PolyATtract®mRNAIsolationSystemIIIPromega公司OrientExpressRandomPrimercDNASynthesisKitNovagen公司EcoRI/HindIIIEndModificationKitNovagen公司DNALigationKitNovagen公司T7Select10-3bCloningKitNovagen公司MiniColumnFractionationKitNovagen公司2000bpDNALadderTaKaRa公司TaqDNA聚合酶TaKaRa公司IPTGAMRESCO公司T7噬菌体载体上下游引物Novagen公司2.1.1.3主要试剂配制5×TBE缓冲液：Tris碱54g/L，硼酸27.5g/L，EDTA（pH8.0）0.5mol/L。使用时用双蒸水稀释至0.5×工作浓度。1%琼脂糖凝胶：琼脂糖1g，加入100mL0.5×TBE溶液。2.1.1.4主要实验仪器分析天平上海民桥精密科学仪器有限公司，FA1104NPH计上海任氏电子有限公司，6173PCR仪WhatmanBiometra，T-Gradient电泳仪北京六一仪器厂自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂，SZ-93紫外/可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司，TU-1810生物洁净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司，BCN-1360B手掌型离心机海门市麒麟医用仪器厂，Lx-100高速冷冻离心机sigma，2-16K液氮容器乐山市东亚机电工贸有限公司电热恒温水浴锅北京市永明医疗仪器厂，DZKW-D-2电热恒温干燥箱黄石市医疗器械厂，72-1隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械一厂，PYX-DHSFluor-S凝胶成像系统美国Bio-Rad公司超低温冰箱中科生命科技股份有限公司，-86℃ZKU-L200Eppendorf管若干（1.5ml、50ml），移液枪枪头若干（10μL-1000μL）2.1.2方法2.1.2.1吸烟者肺癌组织的获取及保存手术后将新鲜组织立即浸入RNALater中，-20℃保存备用。2.1.2.2总RNA的提取和纯化根据RNeasyMiniKit（购自QIAGEN公司）的说明书进行以下实验操作：1）从RNALater保存的组织中剪取一块组织，确定组织的重量，并确保组织不大于30mg，将其放入容器中。2）加入适当体积的BufferRLT（已加入βME），快速进行匀浆处理，直到组织彻底裂解。（组织重量20mg时，加入RLT的体积为350μL或600μL；组织重量为20-30mg时，加入的RLT体积为600μL）3）13000rpm，离心3min，小心地将上清转移到一新离心管中。4）向以上离心管中加入1倍体积70%乙醇，立即吹吸混匀，不要离心。5）将所有物质（包括沉淀）转移到柱子上，轻盖管盖，13000rpm离心15s，弃去流出物。样品多时可多次收集。6）向柱子中加入700μLBufferRW1，轻盖管盖，13000rpm离心15s漂洗柱子，弃去流出物。7）向柱子中加入500μLBufferRPE，轻盖管盖，13000rpm离心15s漂洗柱子，弃去流出物。8）重复步骤79）把柱子放入一新收集管中，全速离心1min。10）把柱子放入一新1.5mL离心管中，加30-50μLRNase-freewater至柱子中央，静置1min，13000rpm离心1min洗脱RNA。11）如果预期RNA产量30μg，用40μLRNase-freewater重复步骤10。如果要得到高浓度RNA，用洗脱液重复10。12）用核酸蛋白测定仪测定RNA的纯度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。2.1.2.3polyA+mRNA的分离纯化使用PolyATractmRNAIsolationKit分离纯化mRNA，原理图如下所示：图1PolyATtract®mRNA分离纯化示意图[77]Fig.