结核分枝杆菌传统药敏试验方法

传统的药敏实验SJKim,TheUnion药敏试验的目的•耐药监测-评估治疗方案-选择有效的标准方案•病例管理-诊断耐药结核病(耐多药/广泛耐药结核病）-为个体病例(耐多药/广泛耐药结核病）选择有效的方案问题►可靠性:技术重复性/临床反应预测►周转时间►操作可行性及可持续性►成本基于标本的药敏检测系统-直接法直接涂片法（涂片阳性）优点:结果快;更好的反映耐药情况缺点:大多数药敏试验不理想;接种量不容易标化/可行性较差-间接法对结核分枝杆菌进行培养后进行药敏试验优点:更好的控制接种量缺点:结果延迟以传统的生长检测为基础的药敏试验方法以传统生长检测为基础的方法WHO（1963）的标准方法绝对浓度法-Meissner-标化接种量;药物浓度梯度抗性比率法-Mitchison-克服培养基中药物浓度变化的缺点比例法-Canetti/Grosset-临界浓度比例,更好的控制接种量[GCanetti/JGrosset,France;SFroman,USA;PHauduroy,Switzerland;MLangerova/LSula,Czechoslovakia;HTMahler(WHO);GMeissner,Germany;DAMitchison,England]以快速培养生长检测为基础的药敏试验方法快培生长系统观察显微镜下的微小菌落:-玻片培养；显微镜观察的药敏试验（MODS）代谢情况检测:-CO2产生量(放射BACTEC460;色素变化MB/Bact3D)-O2消耗(荧光产生MGIT960)-TREK系统(ESP培养系列II)-微盘：阿莫拉蓝试验(指示管)/TEMA-ATP产生,生物荧光试验噬菌体检测:FASTPlaque;Bonxbox(LRP)以检测基因突变为基础的快速药敏试验系统-扩增目标区的DNA测序-聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术;-探针杂交：反向探针线性杂交方法；Hain分枝杆菌药物抗性plus-分子灯塔/信标：GeneXpert系统是一个将样品准备、定量扩增和荧光检集于一身并自动进行核酸检测分析的系统;LAMP(Eiken)核酸环介导等温扩增技术-高效液相色谱应用与扩增的DNA的突变检测药敏试验的结果可靠性治疗结果的预测值-药敏试验的耐药标准试验可靠性-试验精确度&可重复性药敏试验的校正获得最相关的临床耐药标准▽可能的敏感株的敏感级别▽在治疗反应变化方面测定敏感性水平▶从未接受过治疗的患者(PS)与至少接受5/6个月治疗的患者(PR)的标本菌株的敏感性进行比较PS=100菌株;PR=50菌株CanttiG,etal.BullWHO1969;41:21-43.可能敏感菌株/（可能无耐药性菌株）在不同药物浓度下的抑菌分布Minimalinhibitoryconcentrations(MIC)最小抑菌浓度FrequencyofstrainsClinicallysusceptiblestrains(PS)Breakpoint1SD3SD不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)Breakpoint*Technicalvariation(inoculum/media/drugconcent.)Clinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)PSPR2mcg/mlBreakpointISONIAZID010203040506070809010000.10.20.40.81.6Minimalinhibitoryconcentrations(mcg/ml)CumulativepercentagesPS(99strains)PR(117strains)13.1as“R”75.811.1as“S”可能敏感/可能耐药菌株对利福平的最小抑菌浓度的累积分布（此试验采用L-J培养基用绝对浓度法）85.8不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)Breakpoint*InoculumvariationClinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星敏感性分析采用L-J培养基Donotquotethisdata!(n=81)(n=111)校正的乙胺丁醇的临界浓度(此试验采用改良罗氏培养基的绝对浓度法)42%50%可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对卡那霉素敏感性分析InL-JMediumIn7H10Medium67%67%抗结核药物的最低抑菌浓度比平均峰值EMBETHOFXCFXINHRMPKMCPMPASSM推荐的临界浓度药物LJ*7H107H11Bactec460MGIT960异烟肼0.20.20.20.10.1利福平40.01.01.02.01.0乙胺丁醇2.05.07.52.55.0链霉素4.02.02.02.01.0吡嗪酰胺NRNRNR100.0100.0卡那霉素30.05.06.04.0阿米卡星40.01.01.0卷曲霉素40.010.010.01.252.5环丙沙星2.02.02.02.01.0氧氟沙星2.02.02.02.02.0莫西沙星0.50.25加替沙星1.0乙硫异酰胺5.010.02.55.0丙硫异烟胺40.01.252.5PAS1.02.08.02.0环丝酰胺40.0NRNRNRNR氨苯硫脲NRNRNRNRNR利奈唑酮1.01.0*ProportionWHO推荐药敏试验的临界浓度,2007抗结核药物药敏试验1.程序复杂：必须在有质量保证的实验室才能实施2.试验操作危险大：操作只能在拥有好的设施及设备的实验室(BSL-3)进行，而且所有的实验室工作人员都要熟练的掌握每个程序影响药敏试验结果的物理化学环境因素培养基中活动性/精确的药物浓度-药粉.试剂-效价：剂量/溶解/稀释/存储purityxactivefractionxH2OEMB:99%purity;C10H24N2O2.2HCl(277.2-72.9=204.3);nowater;0.99x0.74x1.0=0.7326;1000mg→733mg-培养物的制备：(1)灭菌过程中热失活(2)蛋白结合；(3)拮抗剂/离子(4)pH值接种量:-接种量/离散度/可代表性-组织物的可行性试验浓缩过程中利福平的稳定性抗结核药物的储存在密封的硅胶容器内储存(最好在真空下储存)药敏试验接种物的制备Inoculate0.1mlvolumeofinoculumontoeachmedium比例法(byMiddlebrook&Cohn)Dilute稀释1mg/mlbacterialsuspensionto10-3&10-5mg/mlbyserial10folddilution.Plant接种0.1mlontoeachslopeofdrug-freeorcontainingmedium制备培养基Observe观察thegrowthafter4weeksincubation(ifthegrowthispoor,againafter6weeks).观察4周生长情况（如果培养基质量较差应观察6周）Report报告theproportionofcoloniesgrownatthecriticalconcentrationofthedrug.在药物的临界浓度报告结果DrugfreeIsoniazidEthambutolInoculummedia0.2mcg/ml2.0mcg/ml10-3+++++310-52690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible药敏试验结果-11.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateoneloopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/㎖orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/㎖ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/㎖bacterialsuspensionorifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/㎖.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(㎍/㎖)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4㎎)13+2+11870TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6㎎)2282000InterpretationR(7.1)(2/28x100)S(0.03)(1/2800x100)S(0.6)(18/2800x100)S(0.3)(7/2800x100)MTB药敏试验结果-21.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateoneloopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/㎖orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/㎖ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/㎖bacterialsuspensionorifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/㎖.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(㎍/㎖)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4㎎)14+2+21+3+0TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6㎎)22+50010Interpretation?S??MTB药敏试验结果-31.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateoneloopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/㎖orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/㎖ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/㎖bacterialsuspensionorifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/㎖.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(㎍/㎖)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4㎎)13515000TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6㎎)200000InterpretationRR??MTB药敏试验的技术可靠性外部质量评估17个跨国参比实验室网络第14轮熟练度测试结果（数据来源于ArmandVanDeun2007年）敏感性特异性效能可重复性Isoniazid异烟肼S敏感=13R耐药=17Average(%)99999998100%1314111495%4313Rifampicin利福平S敏感=10R耐药=17Average(%)99999998100%1414121495%3323StreptomycinS敏感=11R耐药=16Average