生物化学第20章 柠檬酸循环资料

第20章柠檬酸循环主要内容•TCA准备阶段•TCA循环阶段•TCA产能计算•TCA的调节•TCA双重作用TCA背景知识1、为什么称为柠檬酸循环、三羧酸循环（Tricarboxylicacidcycle,TCA）、Krebs循环？在有氧的情况下，葡萄糖酵解产生的丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA。乙酰CoA经一系列氧化、脱羧，最终生成C2O和H2O并产生能量的过程，称为柠檬酸循环，亦称为三羧酸循环(tricarboxylicacidcycle),简称TCA循环。由于它是由H.A.Krebs（德国）正式提出的，所以又称Krebs循环。•“Itisconvenienttouseabrieftermforthekindofscheme.Itsessentialfeatureistheperiodicformationofanumberofdi-andtricarboxylicacids.Asthereisnotermwhichwouldserveasacommondenominatorforallthevariousacids,itseemedreasonabletonamethecycleafterone,orsome,ofitscharacteristicandspecificacids.Itwasfromsuchconsiderationsthatthetermcitricacidcyclewasproposedin1937.”（HansA.Krebs,Thecitricacidcycle,NobelLecture,December11,1953）Krebs,1901-1981BriefhistoryofTCA•ThefirstmajorinvestigationintotheintermediarymetabolismofoxidationwasthatofThunberg,whoexaminedsystematicallytheoxidizabilityoforganicsubstancesinisolatedanimaltissues.Between1906and1920hetestedtheoxidationofover60organicsubstances,chieflyinmuscletissue.Hediscoveredtherapidoxidationofthesaltsofanumberofacids,suchaslactate(乳酸盐),succinate(琥珀酸盐),fumarate(延胡索酸盐),malate(苹果酸盐),citrate(柠檬酸盐),andglutamate(谷氨酸盐).•In1932,Krebswasstudyingtheratesofoxidationofsmallorganicacidsbykidneyandlivertissue.Onlyafewofsubstanceswereactiveintheseexperiments---notablysuccinate,fumarate,acetate,malate,andcitrate.•AnimportantdevelopmentcamefromthelaboratoryofSzent-GyorgyiofSzegedin1935,whoconfirmedonpigeonbreastmuscletherapidoxidationoftheC4-dicarboxylicacids-succinic,fumaric,malic,andoxaloaceticacids-andarrivedatthenewconclusionthatthosedicarboxylicacidswerelinkedbyanenzymaticpathwaythatwasimportantforaerobicmetabolism.•AdecisivecontributiontothefieldwasmadeinMarch1937byMartiusandKnoop,whodiscoveredα-ketoglutarate(α-酮戊二酸)asaproductofcitrateoxidation.Becauseitwasalreadyknownthatα-ketoglutaratecouldbeenzymaticallyoxidizedtosuccinate,thepathwayfromcitratetooxaloacetatewasseemedas:•In1937,Krebsfoundthatcitratecouldbeformedinmusclesuspensionsifoxaloacetateandeitherpyruvateoracetatewereadded.Now,hegetacycle:TCA背景知识2、细胞呼吸（cellrespiration）要经历三个阶段：糖酵解阶段、柠檬酸循环阶段、氧化磷酸化阶段。3、糖酵解的产物丙酮酸进入TCA之前有一准备过程，即形成乙酰CoA。TCA准备阶段丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系催化下氧化脱羧形成乙酰辅酶A。丙酮酸脱氢酶系复合物含三种酶和五个辅助因子E1:pyruvatedehydrogenase,thiaminepyrophosphate(TPP)E2:dihydrolipoyltransacetylase,lipoicacid,coenzymeA-SHE3:dihydrolipoyldehydrogenase,NAD+,FADIRREVERSIBLETCA准备阶段H+丙酮酸脱氢酶系作用机理（1）1.丙酮酸与TPP结合并脱羧形成羟乙基TPP。2.羟乙基TPP氧化转变成乙酰基同时转移到E2的辅基硫辛酰胺上。3.在E2上的乙酰基在E2催化下转移到CoASH上形成游离的乙酰CoA.从而形成了一个高能硫酯键。ThemechanisticdetailsofthefirstthreestepsofthepyruvatedehydrogenasecomplexreactionTCA准备阶段TCA准备阶段丙酮酸脱氢酶系作用机理（2）4.还原型的E2将二个SH基H转移到E3的辅酶FAD上形成还原型FADH5.E3上的还原型的FADH将H交给NAD+形成NADH，E3辅基又形成氧化型的FADTCA准备阶段丙酮酸脱氢酶系反应图解E1E3TCA准备阶段砷化物对硫辛酰胺的毒害作用有机砷化物和亚砷酸能与丙酮酸脱氢酶系中的E2辅基硫辛酰胺共价结合，使还原型的硫辛酰胺形成失去催化能力的砷化物。这类砷化物同样表现在对酮戌二酸脱氢酶系的抑制上。R-As=O+HSHSRSRSR’-As+H2OTCA概貌2C6C柠檬酸6C异柠檬酸5C酮戌二酸4C琥珀酰CoA4C琥珀酸4C延胡索酸4C苹果酸4C草酰乙酸1、草酰乙酸与乙酰辅酶A形成柠檬酸—催化此反应的酶为柠檬酸合酶；—反应的中间产物为柠檬酰辅酶A；—柠檬酸合酶属于调控酶，其活性受ATP、NADH、琥珀酰CoA、酯酰CoA等的抑制；另一种抑制剂是丙酮酰CoA。—它是TCA循环的限速酶，由氟乙酸形成的氟乙酰CoA可被该酶催化形成氟柠檬酸，从而抑制下一步的顺乌头酸酶催化的反应。此称为致死性合成反应。TCA循环阶段S-CoAintermediateo哺乳动物体内柠檬酸合成酶以二聚体形式存在。o与草酰乙酸的结合使酶发生有利于和乙酰CoA结合的形变。TCA循环阶段柠檬酸合成酶的单聚体形式，绿色原子为柠檬酸，粉色原子为CoATCA循环阶段草酰乙酸与乙酰辅酶A形成柠檬酸，反应的中间产物为柠檬酰辅酶A。２、柠檬酸异构形成异柠檬酸—催化此反应的酶为乌头酸酶；—反应的中间产物为顺乌头酸；—反应为先脱水后水化；—由于反应生成的异柠檬酸在下一步反应中迅速被氧化而使反应向生成异柠檬酸的方向进行。TCA循环阶段•顺乌头酸酶催化柠檬酸异构化为柠檬酸，反应分两步进行，经历一个顺乌头酸中间体。•反应具有严格的空间特异性。TCA循环阶段•顺乌头酸酶活性位点的铁硫聚簇。TCA循环阶段•氟乙酸到氟柠檬酸的转化TCA循环阶段３、异柠檬酸氧化生成－酮戌二酸—催化此反应的酶为异柠檬酸脱氢酶；—反应为TCA二次氧化脱羧中的第一个反应；—反应中间产物为不稳定的草酰琥珀酸；—既有以NAD+为辅酶的异柠檬酸脱氢酶，也有以NADP+为辅酶的异柠檬酸脱氢酶。—异柠檬酸脱氢酶是变构调节酶，其活性受ADP和NAD+的变构激活，受ATP和NADH的变构抑制。TCA循环阶段-脱羧反应TCA循环阶段4、－酮戌二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA—催化此反应的酶为－酮戌二酸脱氢酶复合体，该酶由－酮戌二酸脱氢酶E1、二氢硫辛酰转琥珀酰酶E2和二氢硫辛酰脱氢酶E3及六种辅助因子TPP、硫辛酸、CoA、NAD+、FAD、Mg2+组成；—反应为TCA二次氧化脱羧中的第二个反应；—反应释放的能量主要存于琥珀酰CoA的高能硫酯键中；TCA循环阶段4、－酮戌二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA—－酮戌二酸脱氢酶是变构调节酶，其活性受产物琥珀酰CoA、NADH和高能ATP的变构抑制。—与丙酮酸脱氢酶复合体中E1不同的是该酶不受磷酸化与去磷酸化的共价修饰调节作用；TCA循环阶段5、琥珀酰CoA转化为琥珀酸并释放高能磷酸键—催化此反应的酶为琥珀酰CoA合成酶或称琥珀酰硫激酶；—该反应为TCA是唯一直接产生高能磷酸键的步骤，也是一步底物水平磷酸化产生能量的步骤；—反应生产的GTP在蛋白质的生物合成中起磷酰基供体及激活信号蛋白的作用，也可以与ADP磷酸化生成ATP相偶联产生能量。TCA循环阶段•琥珀酰CoA合成酶反应机制TCA循环阶段6、琥珀酸脱氢生成延胡索酸—催化此反应的酶为琥珀脱氢酶；它以FAD为辅基；—该酶具有严格的立体专一性，即只生成反式延胡索酸；—与琥珀酸结构类似的化合物如丙二酸、戌二酸等是该酶的竞争性抑制剂。TCA循环阶段TCA循环阶段琥珀酸脱氢酶的铁硫聚簇FAD和琥珀酸脱氢酶的共价结合7、延胡索酸水合成L-苹果酸—催化此反应的酶为延胡索酸酶；—该酶具有严格的立体专一性，即只生成L-苹果酸；TCA循环阶段TCA循环阶段延胡羧酸酶的两种可能的反应机制8、L-苹果酸脱氢生成草酰乙酸—催化此反应的酶为苹果酸脱氢酶；—该酶的辅基为NAD+；—由于草酰乙酸与乙酰CoA合成柠檬酸的反应是高度放能反应，因此通过草酰乙酸的不断消耗来驱使该反应不断向生成草酰乙酸方向进行。TCA循环阶段TCA循环阶段以NAD+作为辅酶的脱氢酶的空间特异性比较TCA循环阶段苹果酸脱氢酶的结构TCA循环阶段TCACycle乙酰草酰成柠檬，柠檬易成α-酮琥酰琥酸延胡索，苹果落在草丛中。1、总反应—离开循环的二分子CO2的碳并非来自进入循环的乙酰辅酶A，而分别来自异柠檬酸脱羧和-酮戌二酸脱羧反应；—每循环一次共产生一个GTP、消耗二个水分子；—每一次循环有4次氧化反应，共产生3分子NADH和1分子FADH2；—每次循环产生的能量：1（GTP）+32.5(NADH)+11.5(FADH2)=10ATP—若从丙酮酸算起则产生：10+2.5(NADH)=12.5ATP—若从葡萄糖算起则产生：12.52+2+2(NADH)2.5=32ATPTCA能量计算AcetylCoA+3NAD++FAD+GDP+Pi+2H2O2CO2+3NADH+FADH2+GTP+2H++CoATCA中C的归宿TCA中C的归宿TCA的调控可看成来自二方面：TCA循环本身所具有的内部相互制约系统的调控和ADP、ATP、Ca2+对循环的调控。1、调控丙酮酸脱氢酶复合体TCA的调控TCA的调控是通过循环的别构效应剂和共价修饰实现的。1、调控丙酮酸脱氢酶复合体TCA的调控丙酮酸脱氢酶复合体的调控1.1.产物调控即由NADH和乙酰CoA控制。这二种物质是和酶的作用底物NAD+和CoA竞争酶活性部位。乙酰CoA抑制E2、NADH抑制E3。1.2.磷酸化和去磷酸化的调控E2上结合有二种酶：激酶和磷酸化酶。激酶使丙酮酸脱氢酶组分磷酸化而失活，磷酸酶则脱去丙酮酸脱氢酶上的磷酸